沉淀反应

目的要求

1．了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。

2．初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法。

原理  将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。

沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原，以诊断传染病。但也用于以已知的抗原测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病。

操作步骤

一、环状沉淀反应（以炭疽为例）

将含有抗原的透明浸出液重叠于含有抗体的免疫血清上，在两液交界处发生环状的白色沉淀物，即称为环状沉淀反应。

炭疽环状沉淀反应又称为阿斯可里（Ascoli）氏反应。具体操作方法如图实9-1所示。

（一）沉淀原的制备

1．热浸法  取被检材料（如各种实质脏器、血液、渗出液等）1～3g，在乳钵内研碎，然后加5～10倍生理盐水混合，用移液管吸至试管内，置于水浴锅中煮沸15～30分钟，用中性石棉过滤，获得的透明滤液，即为被检的沉淀原。如果过滤液混浊不透明，可再过滤—次。

2．冷浸法  用以检查怀疑为炭疽病畜的皮革和兽毛等材料，操作前，先将其高压灭菌30分钟，以保证检查者的安全。然后取被检材料1g，浸于5～10倍的0.5％石炭酸生理盐水中，在室温下或普通冰箱浸泡14～20小时，用中性石棉过滤，透明的滤液即为沉淀原。

（二）方法与判定

用毛细吸管吸取少量炭疽沉淀素血清，沿管壁徐徐注入沉淀反应管内，通常达管的1/3高处，再用另一支毛细吸管吸取制备的沉淀原，沿管壁缓慢注入，使之重叠于炭疽沉淀素血清上面，达到试管的2/3高处（注意！不要发生气泡或摇动）。直立静置，在1～5分钟内，两液面交界处若出现清晰、整齐的环状白轮，则为阳性。

为了验证反应的正确性，检验时可做如下三种对照试验；

1．炭疽沉淀素血清加标准炭疽沉淀原，应为阳性；

2．标准炭疽沉淀原加健康马血清，应为阴性；

3．生理盐水加炭疽沉淀素血清，应为阴性。

二、琼脂扩散沉淀反应（以炭疽为例）

抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具有特异性，则在—定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线。此种反应为琼脂扩散沉淀反应。

由于一种抗原可能含有数种抗原成分，因而在凝胶中的扩散速度也不一样，所以在凝胶中可以和抗血清形成数条沉淀线，每一条沉淀线即代表一种抗原成分。所以琼脂扩散反应除用作微生物的鉴定、疾病诊断外，还可用作抗原成分的分析。该反应的操作方法如下：

（一）琼脂凝胶的制备

1. 取精制琼脂干粉1～1.2g，放入100ml含1／万硫柳汞的磷酸缓冲液（PBS）或硼酸缓冲液（BBS）中，水浴加热融化混匀。

2．融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质。

3．将直径90mm的洁净平皿放在平台上。每平皿倒入热的琼脂15～18毫升，厚度约2.5mm左右。注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中可保存2周左右。

4．将琼脂平皿放于事先绘制好的图案上，用打孔器照图案打孔，外周孔径为6mm，中央孔径为4mm，孔间距3mm，见图9-2。

（三）加样与判定

打孔后用琼脂写字墨水，在琼脂板上端写上日期及编号等。在中央孔加入标准炭疽沉淀原，在外周孔1、2、3、4，各加炭疽沉淀素血清至孔满为止。待孔中液体吸干后，将平皿倒置以防水分蒸发；将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中，置15～30℃室温或37℃恒温箱中，24小时后，即可出现较粗的白色明显的沉淀线用琼脂扩散反应诊断传染病，则是往中央孔滴加被检血清1滴（约0.025～0.05ml），在周围孔滴加不同浓度的抗原各1滴，放湿盒中静置于室温下或37℃恒温箱中2～5天，观察结果。若阳性反应，则在抗原与抗体孔之间出现1～2条或多条白色沉淀线。阴性者，则无白色沉淀线。

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