实验：培养基的制备

目的要求

1．掌握一般培养基制备的原则和要求。

2．熟悉一般培养基制备的过程。

操作步骤

一、培养基的制备原则和要求

培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时，应掌握如下原则和要求：

（一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。

（二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。

（三）培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后，必须置37℃温箱中培养24小时，无菌生长者方可应用。

（四）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿，要求没有抑制细菌生长的物质存在。

（五）制成的培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。

二、培养基制备过程

不同的培养基其制备方法也不同，一般包括以下步骤：

（一）准确称量试剂  根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需试剂必须纯净。

（二）校正pH值  将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1N NaOH和1N HCl调节pH值到适宜范围内。

（三）过滤  将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。

（四）分装  将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内（试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml），塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。

（五）灭菌  培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。

高压蒸汽灭菌，一般采用15磅／平方（即1.05kg／cm²）压力，此时的温度是121.3℃。灭菌20～30分钟后，可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候，首先要把灭菌锅内的冷空气排出，否则，冷空气存在会降低锅内的实际温度，影响灭菌效果。

三、基础培养基的制备

（一）牛肉浸液（肉水）

1．成分  新鲜牛肉 500g ，水1000 ml。

2．制法

（1）取新鲜牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小块，用绞肉机绞碎。

（2）按上述比例加水，浸泡过夜（夏天应将浸泡液放置在低温的地方，防止腐败；如果没有冷藏条件时，可省去浸泡过夜这一步），其间应搅拌数次。

（3）次日取上液煮沸一小时，并不断搅拌。

（4）补足蒸发的水分，用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中，准备灭菌。

（5）置高压灭菌器内，15磅灭菌20～30分钟，置低温、暗处保存备用。

3.用途

用于制备各种培养基的基础液。

（二）肉浸液肉汤（普通肉汤）

1．成分  肉水 1000 ml ，蛋白胨 10g，氯化钠  5g，磷酸氢二钾 2g。

2．制法

（1）将以上成份加温溶于牛肉浸液中。

（2）调pH值为7.4～7.6。

（3）滤纸过滤后分装。

（4）15磅20～30分钟灭菌后备用。

3．用途  作一般细菌培养用。

（三）营养琼脂培养基（普通琼脂）

1．成分  肉水 1000ml，蛋白胨10g，磷酸氢二钾 lg ，氯化钠 5g，琼脂 20g。

2．制法

（1）将上述成分混合后，加热溶解，补足水份。

（2）校正pH值7.4～7.6。

（3）用纱布夹棉花过滤。

（4）分装于中试管或三角瓶中。

（5）高压灭菌20～30分钟后，将中试管摆成斜面，保存备用。

3．用途  一般细菌分离培养、菌种保存或用作特殊培养基。

（四）半固体培养基  基本上与营养琼脂的制备相同，仅将琼脂量减少至0.5～0.7％（1000 ml中加5～7g琼脂）即可。

（五）鲜血琼脂  将灭菌的营养琼脂加热溶化，冷却至45～50℃时，加入5～8％无菌脱纤鲜血（绵羊、黄牛、马和兔等），分装于试管后立即摆成斜面、或倾注于平皿中，待凝固后，置37℃培养1～2日。有污染者废弃；无菌者保存，置冰箱备用。

 无菌脱纤维鲜血的制备：以无菌操作采取动物鲜血（绵羊、黄牛、马从颈静脉采血；兔则从心脏采血），放入带玻璃珠的无菌三角瓶内，摇动5～10分钟，放冰箱中备用。

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