黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究

【摘要】  目的研究黄芩中的黄酮提取方法和抗菌活性。方法利用超声波技术通过正交实验提取黄芩中的黄酮，杯碟法对其进行抗菌活性的研究。结果超声波最佳的提取条件为功率235 W，60%乙醇，料液比为1∶20，提取时间为9 min，黄酮提取率为10.35%。该提取液对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉都有明显的抑菌效果，最低抑菌浓度分别为：1.0，2.0，1.0，0.5，1.0 mg·ml-1；最小杀菌浓度为：1.0，2.0，2.0，2.0，1.0 mg·ml-1。结论超声波技术是提取黄芩黄酮的高效方法，黄芩具有较强的抗菌活性。

【关键词】  超声波提取 黄芩 黄酮 抑菌活性

　　黄芩Scutellaria baicalensis Georgi为常用中药之一，是唇形科植物黄芩的干燥根［1］。其有效成分主要为黄酮类化合物。据报道，黄芩黄酮是一类生物活性较强的天然产物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血压等作用［2，3］。超声波具有加速药材中有效成分溶解、缩短提取时间、提高有效成分的提取率等优点［4］，因此，本文通过正交实验探讨超声波提取黄芩黄酮的最佳提取条件，为大规模高效生产黄芩黄酮提供了有力的理论依据。黄芩黄酮的体外抗菌的研究较少，本研究将最佳提取条件下的黄酮提取液对一些细菌和真菌进行了抑菌实验，旨在开发一种天然的抑菌剂，并为临床用药提供理论依据。

　　1  材料

　　黄芩购于湖南长沙康尔佳药店，粉碎过40目筛，80℃烘干备用。芦丁对照品购于中国上海医药化学试剂公司；供试菌种金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉由本实验室保存并培养。

　　2 方法

　　2.1  提取方法

　　超声波提取法：称取黄芩粉5.0 g，采用L9（34）按表1方法进行超声波提取，提取液过滤，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。表1  因素水平（略）

　　对比实验：①煎煮法：称取黄芩粉5.0 g，加水100 ml，浸泡30 min，煮沸后，文火煎60 min，过滤，共煎煮两次，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。②连续回流提取法：称取黄芩粉5.0 g，加60%乙醇100 ml，水浴回流90 min，过滤，共提取两次，合并滤液，定容至100 ml，摇匀备用。

　　2.2 标准曲线的制作

　　称取在105℃下干燥恒重的芦丁对照品10 mg，用95%的乙醇溶解，摇匀，定容至10 ml使之成为浓度为1 mg·ml-1的芦丁标准品溶液，作为储备液备用。量取上述溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 ml，分别加水至3 ml，加5%的亚硝酸钠溶液0.5 ml，放置6 min，加10%的硝酸铝溶液0.5 ml，摇匀，放置6 min，后加5%的氢氧化钠溶液2.5 ml，混匀，放置15 min后蒸馏水定容10 ml，用紫外分光光度计在510 nm处测其吸光度，得到回归方程为：A＝9.933 9C－0.001 73（R2=0.997 5）。

　　2.3 黄芩黄酮的抑菌实验采用杯碟法测定

　　其抑菌作用，取浓度106～107CFU/ml的各种待试菌悬液0.2 ml，与相应灭菌培养基15 ml混合制成混菌平板，凝固后，在平板上等距离放入4个灭菌牛津杯，每个菌设置3个重复，一个无菌生理盐水为对照，取0.1 ml黄酮提取液加入牛津杯中，细菌37℃，真菌28℃培养18～24 h后，移去牛津杯，量取抑菌圈直径，直径越大抗菌活性越强。

2.4 最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

　　用无菌水将黄芩黄酮提取液稀释，终浓度分别为4，2，1，0.5，0.25 mg·ml-1。取2 ml提取稀释液至15 ml培养基，混匀后，倒入平板，凝固后加入100 μl 106～107 CFU/ml的菌液，涂布均匀，放至37℃/28℃培养24 h后观察结果。菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度即MIC。培养48 h后，菌落被完全抑制的最高稀释度提取物浓度为MBC。表2  正交实验结果（略）

　　利用L9（34）正交实验法优化黄芩黄酮提取条件结果（见表2），各因素对实验结果影响顺序为C>A>B>D，即乙醇浓度对黄酮提取率的影响效果最为显著，其次是超声波功率。最佳提取条件为A3B3C2D3，即在功率为235 W，料液比为1∶20，60%乙醇，提取时间为9 min条件下黄芩提取液黄酮含量最高。以该最佳提取条件进行验证实验，黄芩黄酮提取率为10.35%，RSD＝0.70%（n＝6），因此该最佳提取条件是可行的。

　　2.5 提取方法的比较

　　结果见表3。由表3可知，超声波提取方法的提取率明显高于其它两种方法，且提取时间最短，提取溶剂用量最少。表3  不同的提取方法与黄酮含量的关系（略）

　　2.6 抑菌圈的确定

　　结果见表4。由表4可以看出黄芩黄酮提取液对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉都有较强的抑菌效果。而且对细菌的抑制效果强于真菌。表4  黄芩黄酮提取液的抑菌效果（略）

　　2.7 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的确定

　　结果见表5。由表5可知，黄芩黄酮对金色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉的最低抑菌浓度分别1.0，2.0，1.0，0.5，1.0 mg·ml-1；最小杀菌浓度为1.0，2.0，2.0，2.0，1.0 mg·ml-1。表5  黄芩黄酮最低抑菌浓度和最小杀菌浓度（略）

3 讨论   

　　目前，黄芩总黄酮的提取方法有水煎煮法、乙醇提取法、超声波法、超滤法、微波提取法、高速逆流色谱法、亚临界水提取法等多种方法［5］。本实验用水煎煮法、乙醇回流提取法、超声波提取法比较黄芩总黄酮的提取率，结果表明，超声波提取法的效率最高，达10.35%，提取时间最短。黄酮类化合物是药用植物的一大类有效成分，具有多种生物活性，主要的作用之一是抑菌或杀菌。本实验结果表明，黄芩黄酮对真菌的有一定的抑制作用，是一种天然的抑菌剂，有望用于食品保藏，抗菌消炎等，为黄芩的综合利用开辟了新的途径。

 

 作者：曾超珍，刘志祥，韩磊  《时珍国医国药》

  　　［1］宋双红,张媛.HPLC测定不同产地黄芩中黄酮化合物的含量［J］.中国中药杂志,2006,31(7):598.

　　［2］关晓燕,杨 洁.黄芩药理研究概况［J］.中国医药信息,2006,23(4):21.

　　［3］姚干,何宗玉,方积年.黄芩总黄酮提取及纯化工艺的研究［J］.中成药,2006,28(11):1568.

　　［4］曾超珍,刘志祥,吴耀辉,等.超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研究［J］.时珍国医国药,2007, 18(10):2402.

［5］王梅芳,武坚锐,杨小玲,等.黄芩总黄酮提取工艺的优化［J］.基层医学论坛,2006,10(11)：966