黄连、黄芩对3种厌氧菌的体外抑菌活性研究

【摘要】  目的 研究黄连、黄芩对牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌厌氧菌的体外抑菌活性，为临床筛选中药治疗厌氧菌感染提供依据。方法将黄连、黄芩制成煎剂，采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的琼脂稀释法，测定此2种药物对3种细菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果黄连对中间普氏菌的MIC为1∶640；对牙龈紫质单胞菌、核梭杆菌的MIC为1∶320。黄芩对牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌的MIC为1∶10；对核梭杆菌的MIC为1∶20。结论 黄连、黄芩对上述3种试验菌株均具有不同程度的体外抑菌活性，其中黄连对中间普氏菌的抑菌活性最强，黄芩对3种细菌虽然也显示活性，但均较黄连弱。

【关键词】  黄连；黄芩；琼脂；微生物敏感试验；细菌，厌氧　

　　随着抗生素的大量使用，各种细菌包括厌氧菌的耐药率日趋升高。资料表明，厌氧菌可以通过产酶、细胞膜通透性改变、外排、线粒体突变、耐药基因传递等机制导致耐药率上升，而且长期使用抗生素治疗还可能诱导菌群失调和真菌的二重感染［1～3］。因此，本研究选择了3种致病性厌氧菌牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌作为研究对象，采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的琼脂稀释法，检测中药黄连、黄芩对这3种厌氧菌的体外抑菌活性，以期为临床应用中药治疗厌氧菌感染提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材  料

　　1.1.1  菌株 

　　牙龈紫质单胞菌（Pg ATCC33277）、中间普氏菌（Pi ATCC25611）、核梭杆菌（Fn ATCC10953）均由北京市口腔医院研究所提供。

　　1.1.2  中药煎剂的制备

　　称取黄连100 g，加水1～2 L，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，100目筛过滤。药渣加水0.5～1 L，按上述方法进行再次操作后，过滤药液，合并2次滤液，用文火浓缩为100 mL，使药液浓度为1∶1（每mL药液含生药1 g）。用孔径为0.22 μm的Millex-Gp滤器过滤除菌，4℃保存备用。同样制备黄芩煎剂备用。以上两药购自河北医科大学第四医院中药房。

　　1.1.3  试剂 

　　Wilkins-Chalgren厌氧肉汤、Wilkins-Chalgren厌氧琼脂、M-H琼脂均购于英国OXOID公司。

　　1.1.4  仪器 

　　比浊仪（美国DADE BERING公司），2.5 L厌氧罐（法国BIOMERIEUX公司），改良2.5 L厌氧产气袋、厌氧指示剂、Millex-GP 滤菌器（日本Nippon Millipore ltd 公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  菌株复苏及菌悬液制备 

　　用Wilkins Chalgren 厌氧肉汤将牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌分别复苏，转种至含5%V/V脱纤维羊血的Wilkins Chalgren 厌氧琼脂平板上（该琼脂粉中已含有氯化血红素和维生素K），置厌氧环境中（80%N2，10%H2，10%CO2）35℃培养48 h，经形态、生化实验鉴定为纯培养物后用盐水制备菌悬液，采用麦氏比浊法用比浊仪调菌悬液浓度达0.5 Mcfarland单位［含 (1～2) ×108 cfu/mL］，稀释10倍备用。

　　1.2.2  琼脂稀释平皿的制备 

　　取9支无菌试管，第1管加入1 mL黄连煎剂，2～9管加入1 mL 0.9%氯化钠注射液，第2管再加入1 mL黄连煎剂，2～9管依次做倍比稀释。将Wilkins-Chalgren琼脂融化，置于水浴中平衡置50℃，按5%V/V比例加入脱纤维羊血，无菌操作吸取9 mL加置上述试管中，混匀倾注7 mL于平皿中。使琼脂平皿黄连倍比稀释度分别为1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，黄连浓度分别为100、50、25、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39 mg/mL。同样方法制备含黄芩的Wilkins-Chalgren琼脂平皿。同时设不加中药平皿为生长对照。

　　1.2.3  接种琼脂稀释平皿 

　　用微量多点接种仪将制备好的牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌悬液分别点种1 μL于含不同浓度的黄连、黄芩的Wilkins-Chalgren琼脂平皿上，置厌氧环境中，35℃培养48 h。

1.2.4  黄连、黄芩对3种细菌最小抑菌浓度（MIC）的判定
 
　　判读黄连、黄芩能够完全抑制细菌生长的最低药液浓度为该中药对细菌的最低抑菌浓度，即药物最高稀释度平皿上无菌落生长者，为该药对该细菌的MIC［4］。

　　2  结  果

　　2.1  黄连对牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌的MIC分别是1∶320（3.13 mg/mL）、1∶640（1.56 mg/mL）、1∶320（3.13 mg/mL）。

　　2.2  黄芩对牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌的MIC分别是1∶10（100 mg/mL）、1∶10（100 mg/mL）、1∶20（50 mg/mL）。

　　2.3  中药黄连、黄芩对牙龈紫质单胞菌、中间普氏菌、核梭杆菌3种厌氧菌均有不同程度的抑菌能力。其中黄连对中间普氏菌抑菌能力最明显，比对牙龈紫质单胞菌、核梭杆菌高1个倍比稀释度；黄芩对3种细菌也显示了抑菌能力，但都是在比较高的浓度情况下才有抑菌作用，且抑菌能力均低于黄连。

　　3  讨  论

　　3.1  中药抑菌作用机制 

　　黄连主要的抑菌成分是小檗碱，资料表明小檗碱能抑制酵母和细菌糖代谢中间环节丙酮酸的氧化脱羧过程，较大浓度时可显示对核酸前体掺入的抑制作用，其抑制细菌核酸合成作用在一定浓度范围内随药物浓度增大而增强［5］。黄酮类衍生物是黄芩的主要抑菌成分，具有清热燥湿、泻火解毒等功效。其有效成分可通过阻断细菌的信号通讯通路，降解细菌的内毒素及其破坏细菌细胞生物膜等机制抑制金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌等多种细菌的作用，具有较广泛的抗菌谱［6］。

　　3.2  我们采用2001年美国NCCLS推荐的琼脂稀释法研究了黄连和黄芩对牙龈紫质单胞菌、 中间普氏菌、 核梭杆菌的抑制能力，黄连对这3种细菌抑制作用较强，黄芩较弱。黄芩MIC范围在10～50 mg/mL，与其他研究结论不一致，可能与不同的研究方法有关，有观点认为不同的方法得出的结果存在差异［7］，建议临床试验室应采用标准化的实验方法，以达到研究结果的一致性。

3.3  随着检验技术的提高，厌氧菌感染的检出率不断增加。而厌氧菌对临床常用的氨基糖苷类、磺胺类药物天然耐药；厌氧菌也可通过诱导产酶、基因突变等机制导致对β-内酰胺抗生素高水平耐药［8，9］，给厌氧菌感染治疗带来难度。而中药具有资源丰富、价廉易得、毒副作用低等优点，因此筛选有效的中药对治疗厌氧菌感染具有很大的临床意义。本实验旨在通过采用标准化的实验方法，为临床应用中药治疗该类细菌感染提供准确的试验依据。

 作者：郭秀娟 郑金秀 李宏 《河北中医》

【参考文献】
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　　［4］Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al. Manual of clinical microbiology［M］. 7th ed. Washington DC American. Society for Microbiology, 1999 :1526-1543
　　［5］吴贻谷, 宋立人. 中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社,1996：528-532
　　［6］张喜平,周田美,董晓勤,等.黄芩苷注射液体外抗菌作用实验研究［J］. 医学研究杂志,2006,35 (8):39-41
　　［7］汤亚玲，谭红，叶玲等.黄芩对牙龈卟啉单胞菌生长、形态影响的体外实验［J］.牙体牙髓牙周病学杂志，2002，12（12）：655-657
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　　［9］张秀珍.要加强我国临床细菌室厌氧菌的培养技术［J］. 中华检验医学杂志,2002, 25(3)：133-134

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