正粘病毒诊断
根据流感的典型临床症状及其高度的接触传染性、急性发作和迅速传播等特点，常可作出初步诊断。但为了弄清是由哪一型或哪一亚型病毒引起的，则必须进行实验诊断，即必须进行病毒分离和鉴定或作血清学检查，才能获得确诊，尤其是在首次发现疫情的地区。
(1)病毒的分离和鉴定
A.标本的采集和处理〓病料应在疾病急性期或出现临床症状的最早期采取。由于流感的病毒血症时间短暂，且随动物种类和毒株而异，实验诊断时一般不以病畜的血液作为病毒分离的材料。但鸡患禽流感时，血液中的病毒滴度极高，故可采取病鸡血液分离病毒。采集病马和猪的材料时，最好应用棉拭子醮取鼻道深部或咽部的粘液。禽类可采取气管或泄殖腔粘液和血液，或者扑杀病禽，直接采取肺或鼻窦渗出物分离病毒。将醮取病料的棉拭子立即放入含青霉素(1000ug/ml)的灭菌肉汤(pH72～76)、Hanks液或生理盐水中。如有霉菌污染可能，另加两性霉素(2～5u/ml)。充分振荡，使粘液分散，置4℃冰箱内1～2小时，经1500～2000r/min离心沉淀15分钟后，吸取上清液供接种用。无菌采取的脱纤血可直接作接种用。肺组织应研磨成乳剂。窦渗出物则应适当稀释，并经抗生素处理。如果不能在24小时内完成接种工作，应将标本置于-20℃下保存。采取急性期和恢复后2～3周的双份血清，供抗体检查。
B.接种〓通常应用9～11日龄鸡胚，作羊膜腔和尿囊腔同时接种。每胚注入02ml。每个标本接种8～10个鸡胚。接种后置35℃孵育。于接种后24小时开始检查，同时废弃死胚。此后每隔12小检查一次，取出死胚，收集其羊水和尿囊液，用鸡红细胞检查有无凝集性。即取未稀释的羊水或尿囊液025ml，加入于小试管或血凝滴定板孔内，随后加入1%鸡红细胞悬液025ml，摇匀后静置45～60分钟观察结果。因病毒在鸡胚内初次增殖时，不一定使鸡胚死亡，因此要在孵育4天后将剩余的活鸡胚移至4℃冰箱过夜(或置-30℃冷冻1小时)，按上述方法采样检测HA，同时用新鸡胚进行盲目传代，如经3～4代仍不出现血凝反应，即判定为阴性。
C.分离物的鉴定〓流感病毒可用血凝抑制试验、补体结合试验、中和试验或血细胞吸附抑制试验等方法进行鉴定。为此必须制备型特异性免疫血清和株特异性免疫血清。a.免疫血清的制备：型特异性免疫血清(补体结合试验用)的制备：甲型流感病毒常用甲0型JPR3株，乙型流感病毒常用Lee株。应用这两株病毒的鼠肺适应株，即将其先经小鼠滴鼻感染几代，提高其对小鼠的毒力，以能在滴鼻感染后3～5天使多数小鼠发病，且有部分死亡者为宜。用这样的适应株滴鼻接种一批12～16g小鼠，待其发病并有部分死亡时，解剖小鼠，以无菌手续取肺，制成10%悬液，低速离心沉淀，除去粗大颗粒，吸取上清液，作免疫用抗原。选用300～500g体重的健康豚鼠4～5只，先由每只采血3～5ml，分离血清保存，作为免疫前血清，随后用乙醚轻度麻醉后，以上述感染鼠肺悬液作滴鼻接种，每只05ml，共3～4次，每次间隔1星期。在最后一次滴鼻接种同时，腹腔注射2ml鼠肺悬液。一星期后试血，如对同型尿囊膜抗原的补体结合效价超过1∶80，而与异型抗原不起交叉反应，即可全采血，分离血清，保存于低温冰箱中备用。株特异性免疫血清(血凝抑制试验用)的制备：以特定株病毒接种9～11日龄的鸡胚，孵育2～3天后采取感染尿囊液，低速离心沉淀，除去粗大颗粒，测定血凝滴度，应不低于1∶80。血凝滴度过低时，可连续通过鸡胚数代后应用。取体重2kg以上的健康鸡，先由翅静脉采血2ml，作免疫前血清用。随后静脉注射感染尿囊液2ml，第5天再注射同量的感染尿囊液一次，经7天后试血。如果血凝抑制效价高于1∶160，即可按常规方法采血，分离血清，冻结保存备用。抗体滴度过低时，可再静脉注射感染尿囊液5ml。试血和采血时间的间隔应不超过一天，以免抗体滴度下降。b.鉴定方法：型特异性补体结合试验：已知流感病毒有甲、乙、丙三型。这三型病毒各有其特异的可溶性抗原。将新分离的病毒接种于鸡胚尿囊腔中。如果尿囊液的血凝滴度在1∶40以上，即可采取尿囊膜，用生理盐水洗涤3次，剪成数块，放入试管中。按每个尿囊膜加1ml灭菌生理盐水，置低温酒精中冰冻，随后再置室温中融化，如此冻融3次。而后，经3000r/min离心沉淀15分钟，吸上清液，加1∶10000硫柳汞防腐，保存于普通冰箱中，可用一个月。将上述抗原作1∶2、1∶4、1∶8……直至1∶256的稀释，与甲、乙、丙三型免疫血清进行交叉补体结合试验。各型血清的用量均为4单位。有关补体结合试验的具体操作术式，请参见本书相关章节。必须指出，动物流感病毒，例如马流感病毒、猪流感病毒和禽流感病毒，都是甲型流感病毒。因此，进行型特异性补体结合试验的主要目的，就是确定所分离的病毒是否确系流感病毒。株特异性血凝抑制试验：流感病毒能凝集20多种动物的红细胞，但在血凝和血凝抑制试验中最常用的是鸡和豚鼠的红细胞。先测定新分离病毒的血凝滴度，并于试验前配制4单位HA，与不同稀释度的各株免疫血清分别进行血凝抑制试验。株特异性免疫血清，对同株或同一亚型的病毒呈现明显的血凝抑制作用，通常与其原测定的效价相同或接近。而对不同亚型的病毒则不呈现明显的血凝抑制反应。血凝抑制试验是流感病毒鉴定中最常应用的方法，但也有些问题需加注意，例如不同毒株与抗体的亲和力不同，不同毒株对多种正常血清中的非特异性抑制物的敏感性亦有所不同。由于甲型流感病毒，特别是人的甲型感病毒不断地发生抗原性变异。为了确切地了解抗原变异的幅度，经常应用交叉血凝抑制试验进行抗原分析。所用的免疫血清包括以往流行过的代表株、当前流行的代表株以及新分离的毒株所制备的免疫血清。所用的抗原是与上述免疫血清相应的各株抗原。具体操作方法同血凝抑制试验。将每个免疫血清对所有的抗原都做一次血凝抑制试验。每个抗原均需准确地调节为4个或8个单位。由于血凝抗原易于失效，整个交叉血凝抑制试验应在同次同一条件下进行。根据试验结果，按下式计算抗原比：〖WB〗r=〖KF(〗r1×r2〖KF)〗〖DW〗r1=〖SX(〗甲血清对乙抗原的血凝抑制滴度〖〗甲血清对甲抗原的血凝抑制滴度〖SX)〗〖DW〗r2=〖SX(〗乙血清对甲抗原的血凝抑制滴度〖〗乙血清对乙抗原的血凝抑制滴度〖SX)〗“r”代表两个毒株之间的抗原差别。r值等于1，表示两毒株之间完全相同，是同一亚型病毒。r值愈大，两毒株的差异也愈大，亦即它们之间的类属关系愈小。值在4以上时，表示两毒株之间的差异显著，例如：〖DW〗r=〖KF(〗〖SX(〗1/20[]1/60[SX)]×[SX(]1/20[]1/640[SX)][KF)]=[KF(]256[KF)]=16上述结果说明，甲毒株和乙毒株在抗原性上具有非常明显的差异，很可能属于不同的亚型。中和试验：流感病毒可用鸡胚或细胞培养物作中和试验进行鉴定。一般应用定量病毒和不同稀释度血清的方法，即先将病毒在鸡胚或组织培养细胞中滴定。根据接种72小时鸡胚尿囊液的血凝终点或接种7天后组织培养细胞上的红细胞吸附终点，计算出鸡胚半数感染剂量(EID50)或组织培养物半数感染剂量(TCID50)。中和试验时应用的病毒量为100个EID50或100个TCID50。免疫血清经预先除去非特异性抑制素后，连续的倍倍稀释，加入病毒悬液并经混合后，放室温静置1小时，每个鸡胚或每个细胞管接种02ml。每个血清稀释度接种4个鸡胚或4管细胞，于33～35℃孵育3～7天。检查鸡胚尿囊液血凝性或组织培养细胞的吸附性。能够中和病毒，使鸡胚尿囊液不出现血凝或组织培养细胞不出现红细胞吸附现象的血清最高效价的中和反应，通常与预测的该免疫血清的中和滴度相同或相近。不同亚型病毒与相应免疫血清之间呈现最高效价的中和反应，通常与预测的免疫血清的中和滴度相同或相近。不同亚型病毒和免疫血清之间，通常不呈现明显的中和反应，中和滴度较低或很低。免疫荧光技术：主要用于病料内流感病毒的快速检出，分直接法和间接法两种。应用上述甲、乙、丙三型的型特异性免疫血清，其补体结合效价应在1∶320以上。提纯IgG后，标记异硫氰酸盐荧光素(FITC)，即为直接免疫荧光染色剂。也可应用流感免疫血清作为第一抗体，以抗相应动物IgG抗体的荧光染色剂作为第二抗体，进行间接法染色检测。有关IgG的提取、FITC标记与鉴定以及染色方法等，请参阅本书有关章节。将醮取鼻咽部分泌物的棉拭子，涮洗在10%犊牛血清Hanks液中，经2000r/min离心沉淀20分钟后，取沉淀物涂片，吹干，用冷丙酮固定10分钟，室温干燥后，以磷酸盐缓冲盐水漂洗，而后进行荧光染色。也可将上述感染材料的悬液离心沉淀后，取上清液接种组织培养细胞，孵育16小时后，进行荧光染色。如系接种鸡胚，则于接种后2～3天采集羊水和尿囊液，离心沉淀，再以沉淀物涂片，进行荧光染色。琼脂扩散试验与对流免疫电泳：主要用于新分离毒株的型和亚型的鉴定、抗原关系分析以及动物血清的诊断。由于琼脂扩散试验的敏感性较低，再因完整的流感病毒粒子不易透过琼脂凝胶，所以必须先将病毒浓缩提纯，再用某种去污剂(SDS，SSS，NP40或TritonX100)，将其裂解并适当浓缩后，才能作为抗原。并用单因子血清，例如抗HA血清、抗神经氨酸酶血清、抗内膜蛋白血清、抗核蛋白血清等作为抗体。同时设置各标准毒株作为对照，根据沉淀线融合或交叉，判定被鉴定毒株与标准毒株之间的抗原关系。由于琼脂扩散试验的敏感性较低，近年有人试用对流免疫电泳，取得了良好的结果。神经氨酸酶及其抑制试验：流感病毒NA及抗体的测定，有助于亚型抗原鉴定、NA抗原漂移分析以及人群和动物群中的抗体调查。NA能使粘蛋白分解为N—乙酰神经氨酸。在酸性条件下，高碘酸使NA的碳链断裂，并可与硫代巴比妥酸形成色团，用酸化丁醇提取后，以分光光度计比色，计算NA含量。先将标准免疫血清用生理盐水作1∶5稀释，56℃30分钟灭活后2倍连续稀释，分别加入1个酶单位的被检病毒和蛋白底物溶液，37℃感作2～3小时，以下步骤同NA测定试验。抑制50%酶活力的血清稀释度为NA抑制滴度。病毒RNA凝胶电泳：因甲型流感病毒的基因组由8个片段组成，可在凝胶电泳中出现8条带。不同亚型毒株的RNA凝胶电泳图谱存在差别。病毒发生变异时，电泳图谱也有改变。因此，RNA凝胶电泳是分子水平上分析毒株关系和变异的新方法。先将病毒浓缩提纯，提取RNA，置于含尿素的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，随后用硝酸银染色，观察各片段的迁移率及其与标准毒株的比较。马甲1和马甲2流感病毒是遗传稳定的甲型流感病毒亚型，迄今没有发现明显的变异。因此，从马分离获得病毒以后，即可应用甲1和甲2两个亚型的标准血清进行血清学试验。
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