一、培养基用途和原理：
ONPG培养基用于各类革兰氏阴性杆菌β－半乳糖苷酶的产生能力。也可用于鉴别迟缓发酵乳糖细菌与乳糖阴性细菌，还可将ONPG阳性的葱头假单胞菌（Pseudomonas copacia）及嗜麦芽假单胞菌（Pseudomonas maltophila ）与其它假单胞菌区分开。阳性菌可使培养基变黄，故不宜用于检测黄色细菌。
该培养基的原理为，细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β－半乳糖苷酶渗透酶（βeta-galactosidase permease），它位于细胞膜上，可送乳糖分子渗入细胞。另一种为β－半乳糖苷酶（βeta-galactosidase），也称乳糖酶（Lactase），位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。
具有上述两种酶的细菌，能在24-48h发酵乳糖，而缺乏此两种酶的细菌，不能分解乳糖，乳糖迟缓发酵菌只有β-D-半乳糖苷酶（胞内酶）而缺乏β－半乳糖苷酶渗透酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，须经培养基中１％乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的渗透酶后，才能较快分解乳糖，故呈现迟缓发酵现象。
ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释放出黄色的邻位硝基苯酚（O-nitrophenol,ONP），故由培养液变黄可迅速测知β－半乳糖苷酶的存在，从而确定该菌为乳糖迟缓发酵菌。
二、试验结果判断：
接种微量新鲜培养物，35℃培养13小时，观察结果。培养液变黄则为阳性，如为阴性，继续观察至24h。
三、质控菌株：
阳性菌株：大肠埃希氏菌
阴性菌株：普通变形杆菌
四、使用说明：
（1）ONPG的优点为水解作用快。在有较多乳糖苷酶存在的情况下，可在数分钟内被水解而变黄。将较大量细菌培养物接种于小量ONPG培养基中，常可在１小时内获得阳性结果。
（2）葡萄糖对β－半乳糖苷酶有一定的抑制作用，故应避免使用。
（3）使用生长于含乳糖培养基的细菌进行接种，如三糖铁琼脂斜面上的培养物，可能加速试验反应。
（4）日本坂崎介绍，β－半乳糖苷酶和ONPG试验反应不一定具有相关性。Leminor氏等用肠道菌研究了两者的相关性，他讲ONPG试验阳性菌分为两群。ONPG＋β-gal＋群细菌的ONPG试验在4小时内为强阳性，但ONPG＋β-gal－群细菌的ONPG试验较弱，而且缓慢变为阳性。
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