一、试验原理：
细菌在葡萄糖代谢中生成丙酮酸，从丙酮酸开始，随细菌种类不同而有多种分解途径，有的使丙酮酸进一步分解，生成甲酸、乙酸、乳酸等终产物，有的可以使丙酮酸脱羧变为中性最终产物乙酰甲基甲醇（Acetylmethyl carbinol），亦称3-羧基丁酮（Acetoin）。本试验即为检查某些细菌在葡萄糖代谢中是否产生乙酰甲基甲醇，作为鉴定依据。
乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化为丁二酮（Diacetyl），丁二酮与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。
肌酸或肌酸酐可供给比精氨酸更多的胍基，故有加快V-P试验出现阳性反应的作用。
不加α-萘酚，至少要有10PPm的丁二酮才能出现阳性，加入α-萘酚可使V-P试验的灵敏度提高约50倍而不降低试验的特异性，其酒精液还有增强颜色的作用。在试验中，必须先加入α-萘酚，使其先与丁二酮和胍基复合物结合，然后才能加入40%氢氧化钾溶液，加入量不得超过0.2ml。若加入次序颠倒，氢氧化钾可与蛋白胨某些成分反应产生橙红色而造成假阳性。氢氧化钾作为氧化剂可加速乙酰甲基甲醇氧化为丁二酮，并有助于二氧化碳的吸收。
二、试验结果判断：
三、注意事项：
牛肉浸汤不能用于本试验，因在肌肉浸出物中含有乙酰甲基甲醇、丁二酮以及其它干扰试验的物质，可造成假阳性。
V-P试验阳性菌偶尔也会不出现阳性反应，为避免这种情况，可将加有试剂的培养物于50℃左右轻微加热，阳性菌即出现红色，而真正阴性菌仍保持原色。
在通用培养基中，一般培养1-3天多数能出现阳性反应，培养时间过长，可因产酸而使V-P反应减弱或造成假阴性。
一般来说，V-P试验和甲基红试验多呈相反结果。但应注意，这也不是绝对的，有少数细菌如蜂房哈夫尼亚菌（Hafnia alvei）和奇异变形杆菌有时两试验均出现阳性反应。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽孢杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基甲醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
关于V-P试验培养物的培养温度，一般多采用35℃或37℃，但日本有学者认为37℃培养常使分解乙酰甲基甲醇的酶失去活性，故主张采用28-30℃培养，夏季可培养于室温。已知有少数细菌，如哈夫尼亚肠杆菌，在37℃培养的V-P试验结果常不稳定，需在25-30℃培养，才能获得可靠结果。
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