GBT 4789.8-2016小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

1 范围
本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)的检验方法。
本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:0℃~4℃。

2.2 恒温培养箱:26℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 显微镜:10倍~100倍。
2.4 均质器。
2.5 天平:感量0.1g。
2.6 灭菌试管:16mm×160mm、15mm×100mm。

2.7 灭菌吸管:1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
2.8 锥形瓶:200mL、500mL。
2.9 灭菌平皿:直径90mm。

2.10 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 改良磷酸盐缓冲液:见A.1。

3.2 CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar):见A.2。
3.3 改良Y培养基(AgarY,Modified):见A.3。
3.4 改良克氏双糖培养基:见A.4。
3.5 糖发酵管:见A.5。
3.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见A.6。

3.7 半固体琼脂:见A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见A.8。
3.9 碱处理液:见A.9。
3.10 尿素培养基:见A.10。

3.11 营养琼脂:见A.11。
3.12 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。
4 检验程序

小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。

5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均质袋内,以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。均质后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。
5.2 碱处理
除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。
5.3 分离
将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y 琼脂平板,26℃±1℃培养48h±2h。典型菌落在CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛眼状菌落),菌落大小为1mm~2mm,在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。
5.4 改良克氏双糖试验
分别挑取5.3中的可疑菌落3个~5个,分别接种于改良克氏双糖铁琼脂,接种时先在斜面划线,再于底层穿刺,26℃±1℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。
5.5 尿素酶试验和动力观察
用接种环挑取一满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应足够大,振摇几秒钟,26℃±1℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26℃±1℃和36℃±1℃培养24h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行纯化培养,用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。
5.6 革兰氏染色镜检
将纯化的可疑菌进行革兰染色。小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,大小为(0.8μm~3.0μm)×0.8μm
5.7 生化鉴定
5.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26℃±1℃进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特征以及与其他相似菌的区别见表1。

5.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养琼脂平板上挑取单菌落,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.8 血清型鉴定(选做项目)
除进行生化鉴定外,可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴O 因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5min~1min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无自凝现象;具体操作方法可按GB4789.4中沙门氏菌O 因子血清分型方法进行。
6 结果与报告
综合以上及生化特征报告结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。

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