1. 范围
本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的检验方法。
本标准第一法适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检验；第二法适用于单核细胞
增生李斯特氏菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数；第三法适用于单核细胞增
生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品中单核细胞增生李斯特氏菌的计数。
2. 设备和材料
注: 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.2 恒温培养箱：30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃、20 ℃±1 ℃。
2.3 均质器。
2.4 显微镜：10倍～100倍。
2.5 电子天平：感量0.1 g 。
2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌平皿：直径90 mm。
2.9 无菌试管：16 mm×160 mm。
2.10 离心管：30 mm×100 mm。
2.11 无菌注射器：1 mL。
2.12 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes ATCC19111或CMCC54004）、英诺克
李斯特氏菌（Listeria innocua ATCC33090）、伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii ATCC19119）、斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri ATCC35967）或具相同效果的标准株。
2.13 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923或其他产β-溶血环金葡菌）。
2.14 马红球菌（Rhodococcus equi ATCC6939或NCTC1621）。
2.15 小白鼠：ICR体重18 g～22 g。
2.16 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。
3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。
3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。
3.4 1%盐酸吖啶黄（acriflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1、A.3.2.2。
3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1、A.3.2.2。
3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。
3.7 ALOA (Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)琼脂：见附录A中A.5。
3.8 革兰氏染液：见附录A中A.6。
3.9 SIM动力培养基：见附录A中A.7。
3.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.8。
3.11 5%～8%羊血琼脂：见附录A中A.9。
3.12 糖发酵管：见附录A中A.10。
3.13 过氧化氢试剂：见附录A中A.11。
3.14 李斯特氏菌显色培养基。
3.15 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。
3.16 缓冲蛋白冻水：见附录A中A.12
第一法 单核细胞增生李斯特氏菌定性检验
4. 检验程序
单核细胞增生李斯特氏菌定性检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取样品25 g（mL）加入到含有225 mL LB1增菌液的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1 min～2 min；或放入盛有225 mL LB1增菌液的均质杯中，以8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min。于30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，移取0.1 mL，转种于10 mL LB2增菌液内，于30 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
5.2 分离
取LB2 二次增菌液划线接种于李斯特氏菌显色（或ALOA）平板和PALCAM琼脂平板，于36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在ALOA琼脂平板上为蓝绿色菌落周围有不透明晕圈；在PALCAM琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌显色平板上的菌落特征，参照产品说明进行判定。
注： ALOA平板上的典型菌落为单核细胞增生李斯特氏菌或伊氏李斯特氏菌；如果ALOA平板上菌落不典型，可继续培养48 h，再观察。部分菌株不产生透明晕圈。
5.3 初筛
自选择性琼脂平板上分别挑取3个～5个典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上划线纯化, 于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h,分别接种在木糖、鼠李糖发酵管，于36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。
5.4 鉴定
5.4.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 μm～0.5 μm）×（0.5 μm～2.0 μm）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。
5.4.2 动力试验：挑取纯培养的单个可疑菌落穿刺半固体或SIM动力培养基，于25℃～30℃培养48h，李斯特氏菌有动力，在半固体或SIM培养基上方呈伞状生长，如伞状生长不明显，可继续培养5d,再观察结果。
5.4.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。
5.4.4 溶血试验：将新鲜的羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌(单增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌)和阴性对照菌(英诺克李斯特氏菌)，穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌呈现狭窄、清晰、明亮的溶血圈，斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生弱的透明溶血圈，英诺克李斯特氏菌无溶血圈，伊氏李斯特氏菌产生宽的、轮廓清晰的β-溶血区域，若结果不明显，可置4℃冰箱24 h～48 h再观察。
注：也可用划线接种法。
5.4.5 协同溶血试验 cAMP(可选项目)：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，距离1mm～2mm，同时接种单核细胞增生李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌，于36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌处出现约2mm的β-溶血增强区域，斯氏李斯特氏菌也出现微弱的溶血增强区域，伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌处出现约5mm～10mm的“箭头状”β-溶血增强区域，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象。若结果不明显，可置4℃冰箱24 h～48 h再观察。
5.5 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等对木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行鉴定。
5.6 小鼠毒力试验（可选项目）
将符合上述特性的纯培养物接种于TSB-YE中，于36 ℃±1 ℃培养24 h，4 000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水制备成浓度为1010 CFU/mL的菌悬液，取此菌悬液对3只～5只小鼠进行腹腔注射，每只0.5 mL，同时观察小鼠死亡情况。接种致病株的小鼠于2 d～5 d内死亡。试验设单增李斯特氏菌致病株和灭菌生理盐水对照组。单核细胞增生李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌对小鼠有致病性。
5.7 结果与报告
综合以上生化试验和溶血试验的结果,报告25 g（mL）样品中检出或未检出单核细胞增生李斯特氏菌。
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