非培养检测技术在曲霉菌感染中的临床应用进展
录入时间:2015-6-17 11:25:42
来源：青岛海博生物
曲霉在环境中广泛存在，主要通过呼吸道吸入霉菌胞子进入人体。首先侵人感染肺部进而发肺曲霉菌病。在血液系统疾病、肺结核、慢性支气管炎、支气管扩张、肺癌等免疫抑制患者中曲霉已成为仅次于白念珠菌的重要致病真菌。曲霉菌感染已成为最常见的、传播最广的条件致病霉菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病死率高达30％一50％ 。
传统的真菌分离、培养和组织病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、敏感、特异的诊断方法是目前条件性曲霉菌感染实验诊断研究领域的热点。近年来，国内外相继建立了一系列非培养的检测技术，现综述如下：
一、特异性抗原的检测
1 半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM>是存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守性的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子的标志物。基本化学结构为B一(1，4)．苷链连接成的D一吡喃甘露糖为主链，以(It一(1，6)-苷链连接成的D-吡喃半乳糖构成为支链。每个GM上有十几个这样的半乳糖表位可被抗GM的单克隆抗体EB—A：识别。当曲霉菌吸入进入人体肺组织中吞噬细胞便快速将它吞噬，消化处理后释放出真菌细胞壁结构成分。通过血清、支气管肺泡灌洗液、尿液、脑脊液均可监测到半乳甘露聚糖。其检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和乳胶凝集试验(LA)等，最低检测限度为5—10 pg／mL。其中LA和ELISA 已经商品化应用较广泛。Kauffmann—Lacroix等 比较LA、ELISA、直接镜检和组织活检各方法在诊断真菌性鼻窦炎的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值，发现直接镜检法检测敏感性低，影响临床及时的诊断与治疗，组织活检敏感性高，但临床很难广泛开展。Acosta 报道GM阳性结果较曲霉菌培养早4．3天。2003年美国FDAGM检测批准血GM监测用于血液、肿瘤等免疫低下者侵袭性曲霉感染的诊断指标 J。对高危患者每周2次连续动态监测具有早期诊断价值。临床常用试剂为美国platelia Aspergillus(Bio—Rad)GM ELISA，用ELISA(EB一2单抗，双夹心法)的方法检测GM(EBA一2单抗)。国内外研究多采用同样的试剂和方法，但报道的判定界值尚不统一，主要原因是待检人群不同，实验条件限制以及采样频率等有关 。Fujiuchi S 在2001—2008年研究了1511肺部慢性疾病包括肺结核、COPD、肺间质纤维化等肺部慢性疾病患者，当GM>0．5时，敏感性63．4％ ，特异性68．6％ ；当GM>0．51时，特异性更高；美国FDA判定血
GM>0．5为阳性，欧盟判定I>0．51为阳性。目前欧美专家一致认为两次，GM>0．5可判定阳性 J。除了血液标本支气管肺泡灌洗液检测GM是研究热点，Park SY 报道了肺泡灌洗液GM包括359例患者，当BAL—GM≥0．5时其敏感性达64％ ，特异性89％ 。国外He H等 提出血联合BALF检测GM可提高IPA早期的诊断率，需要进一步研究证明。
GM检测对诊断曲霉菌感染有临床意义，但少数情况下它可出现假阳性、假阴性。假阳性与进食牛奶、应用青霉素如哌拉西林／他唑巴坦等有关。新生隐球菌的荚膜含有与GM呈交叉反应的表位，可出现假阳性。另外棘白菌素类抗真菌药物的作用靶点为破坏真菌的细胞壁，因此在使用该类药物后同样出现假阳性。假阴性与抗真菌治疗、病灶局部被纤维组织包裹未侵入血、组织液或与血液中的多种物质结合后使其抗原表位被封闭、体内产生高滴度GM抗体有关。
2 1，3一B．D葡聚糖抗原(G试验) 除结合菌和隐球菌除外的所有真菌的一种特异性的细胞壁成分，监测标本为血清，其敏感性和特异性均达到80％ 。此项检测被美国FDA和欧洲许多国家批准用于血液、肿瘤等免疫受损者中。因对定植的念珠菌显示阴性 l 常与GM联合监测进而提高曲霉菌感染诊断的敏感性，BG和GM均阴性基本可排除真菌感染。但血清学BDG检测容易受到血液学及其他因素影响如纤维素类物质：手术中使用的纱布、海棉、血液透析中的纤维素膜、静脉应用免疫球蛋白和白蛋白等。而且其在血液中可与抗体形成免疫复合物，并迅速被血液清除，造成假阴性 。
二、特异性抗体的检测
侵袭性真菌病多为免疫受损宿主，常常缺乏可检测到的抗体，或者抗体的产生变化较大。国外报道利用从真菌提取的天然抗原建立了多种地方性真菌病血清学检测，包括芽生菌病、球抱子菌病、组织胞浆菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期诊断及流行病学调查，并显示出较高的敏感性和特异性，在某些地方性条件性真菌感染显示出一定的应用价值 。国内外研究曲霉菌特异性抗体均较少，敏感性和特异性较差，早期诊断价值不大。
三、特异性核酸的检测
通过分子生物学技术特别是PCR扩增可在短时间内检测微量的真菌DNA。临床标本可选择血液、尿液、BAL、脑脊液及玻璃体液，等。国外Raad等” 用PCR检测了249例癌症患者的BAL中曲霉的线粒体和碱性磷酸酶基因，敏感性、特异性及阳性、阴性预期值分别为80％ 、93％ 、38％和99％ 。Sanguinetti 采用实时定量PCR法对4J4例IPA患者BAL中几种睦霉菌(烟曲霉、黄曲霉、灰绿曲霉、黑曲霉和土曲霉)共有的18sRNA编码基因上一个124bP的保守片段进行检测敏感性90％ ，特异性100％ 。Real—timePCR可以在封闭状态对扩增产物进行检测，可避免扩增产物污染而引起的假阳性结果。同时还可以结合限制性内切酶来分析区别鉴定致病菌的种属。因此随着实时PCR技术的完善和发展，通过监测曲霉的DNA水平实施疗效监控提示预后，将大大提高PCR用于临床系统性真菌感染早期诊断的价值。
四、特异性代谢物的检测
检测真菌感染代谢物D一甘露聚醇(mannito1)可用于曲霉菌感染的诊断。国外动物实验研究报道曲霉菌D一甘露醇水平明显高于非感染对照组 J。而国内相关报道尚未见明确报道。由于不同菌株产生代谢物能力差别较大，而且受体内代谢物及其他微生物代谢物的干扰，检测所需的仪器设备要求较高，目前仍处于科研阶段，临床常规应用受到限制，因此需要更大量的实验进一步证实。
五、免疫组化
免疫组织化学是用标记的抗体或抗原对细胞或组织中的相应抗原或抗体进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的显色反应舌，显微镜进行观察，具有特异性、敏感性高的优点，并可将形态学和功能代谢密切结合。国外已有制备出鼠抗烟曲霉单克隆抗体，兔抗新型隐球菌及兔抗白念珠氢多克隆抗体。该方法国内外研究尚处于动物试验阶段，临床应用未见相关报道。
非培养的曲霉菌检测技术具有快速、简便，敏感性、特异性高的优点，在诊断曲霉菌感染有重要的价值，为临床早期快速诊断侵袭性曲霉菌感染带来了希望，对及时控制病情、疾病
的预后具有重要意义。随着对真菌基因分析和成分的深入研究，以及新的更先进检测技术的问世，非培养的快速检测技术，将成为曲霉菌感染实验室诊断的重要手段。
上一篇：培养基与培养时间对检测水体中细菌总数的影响
下一篇：空气中微生物的检测沉降法
