糕点、糖果中细菌总数的测定

1、原理

菌落总数是指食品经过处理并在一定条件下培养后，所得1ml（g）检样中所含细菌菌落的总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可用以观察细菌在食品中繁殖的动态，细菌菌落总数的测定一般用国标标准规定的平板计数法，所得结果只包含一群能在营养琼脂上生长的嗜中温需氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所有细菌的菌落总数。由于菌落总数并不能区分细菌的种类，故常被称为杂菌数或需氧菌数等。

食品种菌落总数越多，说明食品质量越差，病原菌污染的可能性越大；当菌落总数仅少量存在时，病原菌污染的可能性就会降低，或者几乎不存在。但不能单凭菌落总数这一项指标来评定食品卫生质量的优劣，必须配合大肠菌群和病原菌项目的检验，才能对食品做出比较全面准确的评价。

2、材料

1）培养基及试剂

●营养琼脂培养基（见附录C）

●无菌生理盐水

●75%（体积分数）乙醇

2）器皿及其它用品

●冰箱

●恒温培养箱

●恒温水浴锅

●托盘天平

●可调式电炉

●吸量管

●广口瓶

●三角瓶

●玻璃珠（直径为5mm）

●平皿（皿底直径为9mm）

●试管（18mm×200mm）

●试管架

●酒精灯

●均质器或乳钵

●剪刀

●灭菌镊子

●75%（体积分数）酒精棉球

●玻璃蜡笔

●登记本

●不锈钢勺等

3、菌落总数的检验程序见下表：

菌落总数的检验程序

检样→做成几个适当倍数的稀释度→选择2~3个适宜的稀释度，各取1ml加入灭菌平皿内→每皿内加入适量营养琼脂→（36±1℃，48±2h）菌落计数→报告

   4、检样稀释及培养

1）以无菌操作，取样25g或25ml放入含有225ml灭菌生理盐水的三角瓶或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成（1：10）的均匀稀释液

2）用1ml无菌吸量管，吸取（1：10）稀释液1ml，注入含有9ml生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管，使其混合均匀，制成（1：100）稀释液。

3）另取1ml无菌吸量管，按上述操作顺序做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml无菌吸量管。

4）根据对糕点及糖果的卫生标准要求，选择2~3个适宜稀释度，每稀释度吸取1ml稀释液置于灭菌平皿内，一个稀释度接种两个平皿。

5）立即将预先冷却至45℃的营养琼脂培养基15ml倾入平皿内，并转动平皿使其均匀。同时，将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。

6）琼脂凝固后，翻转平皿，置于（36±1）℃温箱内培养（48±2）h，取出，平板内的菌落数乘以稀释倍数，即得每克样品（或每毫升溶液）所含菌落总数。

5、菌落计数方法

作平皿内菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。有条件时还可用魁北克菌落计数器或菌落自动计数器。在计下各皿内菌落数后，求出同稀释度的各皿内的平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板在0~4℃下存在，但不要超过24h。

6、菌落计数的报告

1）平皿菌落数的选择选取菌落数在30~300个之间的平皿作为菌落总数的测定标准。一个稀释度应采用两个平皿内的菌落平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应采用无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布有很均匀，则可计算半个平皿后乘2，以代表全皿菌落数。

2）稀释度的选择

①应选择平均菌落数在30~300个之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。见下表例1。

②若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间，则应视两者之比如何来决定。若其比值≤2，应报告平均数；若＞2，则报告其中较小的数字。见下表例2、例3。

③若所有稀释度的平均菌落数均＞300，则应按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。见下表例4。

④若所有稀释度的平均菌落数均＜30，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。见下表例5。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300个之间，其中一部分＞300或＜30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。见下表例6。

⑥若所有稀释度均无菌落生长，则以＜1乘以最低稀释倍数报告之。见下表例7。

3）菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告；＞100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。见下表：

稀释度选择及菌落数报告方式

7、结果

①将试样测出的样品数据以报表方式报告结果。

②对样品细菌总数做出是否符合食品卫生要求的结论。

8、注意事项

①检验中所需玻璃仪器必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底清洗干净，不得残留有抑制物。用作样品稀释的液体，每批都要有空白对照。

②检样的稀释液可用灭菌盐水或蒸馏水。如果对含盐量较高的食品（如酱品）进行稀释，则宜采用蒸馏水。

③注意每递增稀释一次，必须另换一支1ml灭菌吸量管，使所得检样的稀释倍数准确。

④为防止细菌增殖产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min内倾入琼脂，并立即使之与琼脂混合均匀。

⑤为了控制和了解污染，在取样进行检验的同时，于工作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的时间相当，然后与加有检样的平皿一起培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空勤的污染。

⑥培养温度应根据食品种类而定。

⑦加入平皿内的检样稀释液（特别是10－1的稀释液）有时带有检样颗粒，为了避免与细菌菌落发生混淆，可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃环境中放置，以便于在计数检样菌落时用作对照。

⑧检样若是微生物类制剂（如酸乳、乳酒），则平板计数中应相应地将有关微生物排除，不可并入检样的菌落总数中作报告。

⑨平板培养计数法，只能检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，计数总是比食品中实际存在的细菌数要少。但仍能借此评定整个食品被细菌污染的程度，一般食品的卫生检验中都普遍采用这种方法。

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