2015版中国药典微生物项变化的应对策略—菌种

1、 检验用菌种的选择

在药典第三次征订意见稿《9203 药品微生物实验室质量管理指导原则》的“菌种”项下有这么一句话“药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的可以溯源的商业派生菌株”。这句话写明了中国药典对检验用菌种的挑选原则，感觉上可以使用CMCC（中国医学微生物菌种保藏管理中心）、ATCC（美国典型菌种保藏中心）、NCTC（英国典型菌种保藏中心）等等，最近还有供应商给我推荐CICC（中国工业微生物保藏中心）的菌种。但是我们作为遵循中国药典的企业来说，中国药典微生物限度及无菌检查项下的菌种是明确写明仅可使用CMCC的菌种，所以大家没有必要去挑战权威性，如果你使用ATCC的菌种，检查官到时候问你ATCC和CMCC的区别，我相信我们这种等级的肯定是说不清的，这个项目是中检所在做的研究，所以我们不去做这样的挑战，乖乖的选择符合我国国情的CMCC菌种即可，免去一系列无意义的解释。

当然有些企业的产品需要出口，要符合出口国的药典标准，国外相对来说就放宽很多，但是也有一部分国家不太承认我们的CMCC菌种。在我的工作经历中，发现国内的审计官员对微生物方面了解的甚少，但是有次我们企业请了一名国外资深专家来我们公司全面审计的时候，他一看我们检出的环境菌种就娓娓道来，让我很吃惊，我不知道是不是国外对于微生物这块的重视程度和我国还有一定差距还是什么，他们的药典中对于检验菌种的挑选也不止一种，认可范围更加宽泛。现在迎审过程中，我们微生物实验室更多的是解释而非探讨，我们也希望国内的检查团队中能多一些对微生物了解的老师来给我们帮助和指导。

2、 检验用菌种的管理

我们实验室对于菌种的管理也历经了不少波折，现在的管理模式和使用下来的效果还是比较令人满意的，菌种其实最怕就是其活力消退或变异。有些外企的管理模式真的非常方便，使用定量菌株直接实验，可能现在还不太适用于我们大部分国内企业，因为他们使用的定量菌株是ATCC等授权的国外企业制造并供货的，确实非常精准，特别是M家的首席产品，我就不多说了以免有广告嫌疑，国内应运而生的定量菌株我个人还是保留意见。出去培训时还是会发现有很多国内企业对于菌种的管理方式特别是保藏方法存在一定问题，菌种死亡变异的事件还是时有发生。以下我就介绍下我们企业的菌种管理模式，并介绍2种比较方便的菌种保藏方法。

药典的标准菌株大部分企业都会有以下七种：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉，这些菌种我们是依据保藏的效期，在每年的年末购买一次，购买的是次年要过保藏效期的标准储备菌株。这里大家可能就会有疑问了，为什么我们只有标准储备菌株，那是因为我们只购买CMCC标准菌株，即0代菌株，仅保藏使用0代复苏出来的1代标准储备菌株，使用的即是1代标准储备菌株复苏的2代菌株，这样的话最大程度上避免活力及变异事件的发生，因为实验室日常也没有精力去处理这些事情，所以在10版药典的时候，我们就把管理模式重新调整了一下，整个流程为菌株申购→菌株验收→菌株确认→菌株保藏→菌株领用→菌株使用→菌株销毁。

1） 菌株申购

购买检验用菌株，必须由检验用菌株的管理人员提出申请、阳性室负责人审核、部门经理批准后方可进行购买，公司的采购人员必须凭着被签批的单子才能够进行菌种的购买，因为这毕竟关系到生物安全问题，所以申购必须慎重。

2） 菌株验收

每支过来的0代安瓿必须经过确认，实验室至少要进行菌落形态和革兰氏染色的实验，有条件的话通过生化或其他方法确认到属种。该实验是确认菌株的纯度、活力和特性，我们是确认复苏后的1代标准储备菌株，即我们保藏的菌株，保证保藏的菌株的质量。

3） 菌株保藏

其实在确认同时我们即进行了保藏，若确认不合格，则销毁该批次保藏批的菌株，我们实验室的保藏方法很简单，也是借鉴08-09年我的领导去中检所培训带回来的保藏方法，即使用液体培养基复苏菌液，然后加入等量的20%甘油，制成含10%甘油的菌悬液，然后分装至1ml/支，可以保存2年，但是黑曲霉我们是保藏孢子悬液，贮存于-15℃以下，有效期是1年。

现在也有很多实验室使用磁珠法保藏也是觉得效果不错，其保藏后贮存在2-8℃，效期1年。

两个方法各有利弊，甘油冷冻法每次实验使用一支，不会重复使用，避免重复冻融对菌株的挑战以及重复开管引入的污染；但是磁珠法因为是好几颗磁珠放在一管保存液里，每次使用会从该管里夹取一粒复苏，可能重复操作引入污染，但是其优势在于对冰箱温度要求不高，一般实验室都有满足2-8℃的冰箱，而甘油冷冻管需要冷冻室进行保存，所以对没有—15℃以下温度保证的实验室来说，还需购买相应设备，这个就是各自实验室去评估选择了。

这里我还是不太建议使用斜面，一两个月就要转一次，日常事情较多且对于菌株的确认其实在传代过程中也需要进行实验确认，这样又带来附加实验，一支买来的商业派生菌株（一般在省所买来的最少也是2代了，基本都会是3代这种）管不了太久又需要买了，本来很多微生物实验室人手就不够，转种的多还要多配培养基，没必要把精力放在这些事情上，如果实验室没有冷冻冰箱，那可以考虑磁珠法，有的话可以考虑甘油冷冻法，这样可以把工作菌株的使用有效期延长到1-2年。

还有要提一下保藏培养基的问题，之前金葡、大肠、枯草、铜绿都是使用营养肉汤，生孢使用硫乙醇，白念使用马丁，黑曲霉使用TSA进行复苏，15版使用TSB、SDB、SDA了，我暂时不考虑更换细菌培养基，因为毕竟使用那么多年保藏效果比较理想，而且TSB有糖的问题，不过我还是觉得营养肉汤早晚会退出历史舞台，与其等到那时候束手无策，毕竟菌株保藏都是以年来计算的，到时候没得卖就完蛋了，还不如把事情做在前面，在保证菌株储备齐全的情况下，同步要挑战使用TSB保藏金葡、大肠、枯草、铜绿的实验（至少1年），生孢依旧硫乙醇，白念使用SDB，黑曲霉使用SDA。还有使用新的培养基复苏的菌浓问题，基本都比老的长的好，各个实验室可以先行试一下。

4） 菌株领用

我们保藏菌株的冰箱是双人双锁，2 把锁分别在阳性实验人员及阳性室负责人手上，日常取用菌株进行实验必须2人到场开冰箱取菌株，并在菌株领用台账上说明领用日期、原因、领用人等信息，保证菌株的流通可控。

5） 菌株使用

说到菌株使用我觉得我还是有些实验洁癖的，很多实验室是在生物安全柜内几个菌一起做，比如今天有3个菌的实验，都会安排在一起做。但是在我们实验室，我是严格要求在A菌和B菌之间必须清场，A菌实验使用的稀释液、枪头盒等必须撤离现场，消毒安全柜后开紫外灯30min以上，才可进行B菌株实验，并且B菌实验使用的肯定不能是A菌实验使用余下的那些稀释液和枪头。因为实验时产生的气溶胶是我们肉眼看不见的，虽然在混匀菌液时候我们是盖紧试管盖的，但是在打开盖时我无法判断是否有带菌气溶胶跑到空气中沾到哪里，我承认只要是无菌操作过关是不会交叉污染的，但是我不敢冒这个险，还是老老实实遵循着避免交叉污染的宗旨，就和生产清场的概念一样。

还要提一下黑曲霉，其实国内有很多厂家还没有购买黑曲霉，当时他们问我的时候，我真的很奇怪他们怎么通过新版GMP审核的，这个暂且不论，反正我们实验对黑曲霉的处理倒是挺顺利的，当时10版药典和中检所SOP上都写着用棉花放在管口防止孢子飞出什么的，我嫌麻烦，于是想了个法子，我们的试管是用胶质的试管塞的，斜面上黑曲霉长好后，用一次性注射器吸取稀释液从试管塞与试管的缝隙中插进去，因为试管塞是有弹性的，那么细的针头是肯定能从其边缘插进去的，记得塞子始终保持紧闭，然后将液体打入管内直至覆盖所有黑曲霉生长的范围，然后微微震荡将孢子洗脱出来，洗脱后，将塞子打开（因为所有菌体均以被液体覆盖故孢子飞散可能性降低很多）使用枪头或移液管吸取孢子悬液进行稀释即可，当然取原液时候的动作应快速，减少其气溶胶与空气的接触时间，至少我们实验室没有发生过一次污染，而且黑曲霉的实验接入量控制的也很稳定。

对于菌株梯度稀释定量的问题，这里我就不多说了，这个只有多加练习了，而且每个人的梯度确实会有偏差，我们实验室是定好复苏后的培养时间，比如金葡培养24h，那以后每次都是这个时间，这样的菌浓一般都差不多，比较好控制，这个就是勤练！当然你的计数培养基必须质量稳定，否则到时候因为计数培养基的质量问题而导致你一直认为自己稀释的功夫不到家就没话说了。我们实验室实验都是当天直接稀释并接种的，菌量的成功率还是很高的，当然实验人员都是下了一定功夫的，特别是那个比较无语的50-100cfu。

黑曲霉的孢子悬液、枯草的芽孢悬液和生孢的芽孢悬液都是可以经过验证增加贮存时间的，具体的方法可以去网上查文献，我觉得这个还是很有用的，使用起来很方便，关键减少工作量啊！！加个方法验证即可，恶心小段时间，舒服大段时间！

6） 菌株销毁

这里的菌株除了保藏的标准储备菌株外，还有使用该菌株复苏出的菌液、梯度稀释的菌悬液以及菌株计数平皿，这些销毁都是要记录在案的，这个就是整个的流通过程，菌株的销毁也是要经过阳性室负责人批准后执行，并且销毁后还需要阳性室负责人复核确认。

3、 菌种实验室（生物安全实验室）的认证及安全管理

在新版GMP中对于阳性对照室有明确的规定，必须符合P2生物实验室级别，现在还是有很多药企的微生物实验室对P2这个概念有点模糊，这里解释一下，P2实验室即二级生物安全实验室，相当于BSL-2级病原微生物实验室，该级别实验室主要用于初级卫生服务、诊断和研究，其实验对象的危害等级为Ⅱ级（中等个体危害，有限群体危害），具体定义为“能引起人类或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病源体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和 预防措施，并且传播风险有限”。这类的实验室就是P2级的实验室。其实大家日常并不陌生，只是看到了没注意而已，在各大医院都是有生物安全实验室的，只要是黄色醒目的标牌上面有生物安全标示（生化危机里的那个），上面写着无关人员不得入内等，那就是生物安全实验室了。

刚刚提到了P2实验室相当于就是BSL-2级病原微生物实验室，那我们的阳性室基本上应该都是要符合BSL-2级病原微生物实验室的，BSL-2级病原微生物实验室是可以在各省市或区县的卫生局进行认证备案的，那也就是说如果检查官问你，请问你们实验室是否符合P2实验室的生物安全要求，那你不用多做解释，只需将BSL-2级病原微生物实验室的备案证书给他就可以了，在前面列举的那些如铜绿假单胞菌、白色念珠菌均属于BSL-2级病原微生物，这个备案也需要一定过程，卫生局的老师会根据你的实验室布局提出自己的意见，我们实验室是经过设施改造后最终达标的，每年均会进行一次突击的飞行检查（不会提前一天，比如9点打电话10点就到现场了），我个人觉得管理力度还是非常够的，能很好的督促我们严格的管理我们的生物安全实验室。

那对于使用菌株的生物安全实验室，安全问题非常非常的重要，菌株的无故外泄、人员实验室的溢撒事件等等都是一系列需要关注的问题。我们在阳性室设置门禁，避免无关人员进入；在设备方面我们尽量做到阳性室专用，如菌株保藏专用冰箱、菌株专用培养箱、菌株专用灭菌器，这些全部设置在生物安全实验室内部；对于生物安全的管理设有专门的生物安全委员会，有处理各种生物安全事件的应急预案，每年都会进行应急演练并拍照和录像，每年会对整个生物安全实验室进行整体评估出具评估报告，并且每年对生物安全实验室的人员进行生物安全培训，让每一位参与菌株实验的人员都明白其中的重要性。

菌株的事情可大可小，我们在认识这种活体小东西的同时必须尽可能的了解它们的特性，让它们为我们所用，并尽量避免安全事故的发生（SARS就是从实验室出去的。。。），所以我们必须特别小心谨慎的操作它们，最重要的还是这点——保护好自己！！！

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