大分子物质的水解试验

 (一)目的要求
1．证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2．掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。
(二)基本原理
微生物对大分子的淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白质为氨基酸等。这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实：淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。脂肪水解后产生脂肪酸可改变培养基的pH，使pH降低，加入培养基的中性红指示剂会使培养基从淡红色变为深红色，说明胞外存在着脂肪酶。
微生物可以利用各种蛋白质和氨基酸作为氮源外，当缺乏糖类物质时，亦可用它们作为碳源和能源。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式存在。而在25℃以上明胶就会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。
还有些微生物能水解牛奶中的蛋白质酪素，酪素的水解可用石蕊牛奶来检测。石蕊培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是昏浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后，培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常被用来检测乳糖发酵，因为在酸存在下，石蕊会转变为粉红色，而过量的酸可引起牛奶的固化(凝乳形成)。氨基酸的分解会引起碱性反应，使石蕊变为紫色。此外，某些细菌能还原石蕊，使试管底部变为白色。
尿素是由大多数哺乳动物消化蛋白质后被分泌在尿中的废物。尿素酶能分解尿素释放出氨，这是一个分辨细菌很有用的诊断实验。尽管许多微生物都可以产生尿素酶，但它们利用尿素的速度比变形杆菌属(Proteus)的细菌要慢，因此尿素酶试验被用来从其他非发酵乳糖的肠道微生物中快速区分这个属的成员。尿素琼脂含有蛋白胨，葡萄糖，尿素和酚红。酚红在pH6.8时为黄色，而在培养过程中，产生尿素酶的细菌将分解尿素产生氨，使培养基的pH升高，在pH升至8.4时，指示剂就转变为深粉红色。
(三)器材
1．菌种   枯草芽胞杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，普通变形杆菌。
2．培养基  固体油脂培养基，固体淀粉培养基，明胶培养基试管，石蕊牛奶试管，尿素琼脂试管。
3．溶液或试剂   革兰氏染色用卢戈氏碘液(Lugol’s iodine solution)。
4．仪器或其他用具   无菌平板，无菌试管，接种环，接种针，试管架。
(四)操作步骤
l．淀粉水解试验
(1)将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
(2)用记号笔在平板底部划成四部分。
(3)将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在四部分写上菌名。
(4)将平板倒置在37℃温箱中培养24h。
(5)观察各种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量Lugol’s碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉己被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。
2．油脂水解试验
(1)将溶化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布。无菌操作倒入平板，待凝。
(2)用记号笔在平板底部划成四部分，分别标上菌名。
(3)将上述四种菌分别用无菌操作划+字接种于平板的相对应部分的中心。
(4)将平板倒置，于37℃温箱中培养24h。
(5)取出平板，观察菌苔颜色，如出现红色斑点说明脂肪水解，为阳性反应。                        
3．明胶水解试验
(1)取三支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)用接种针分别穿刺接种(见图3—4B)枯草芽抱杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置20℃中，培养2～5d。
(4)观察明胶液化情况(图16-1)。
4．石蕊牛奶试验
(1)取两支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置35℃中，培养24～48h。
(4)观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。
5．尿素试验
(1)取两支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
(2)分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。
(3)将接种后的试管置35℃中，培养24~48h。
(4)观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时应为黄色。
(五)实验报告
1．结果
将结果填入下表，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2．思考题
(1)你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
(2)不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
(3)接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？
(4)解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？
(5)为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？
  
   

 

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