一、实验目的和内容
目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。
内容：1．细菌的芽泡染色。
2．细菌的荚膜染色。
二、实验材料和用具
枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。
二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀绿水溶液、0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95%乙醇、石炭酸复红染液；
显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l×6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。
三、操作步骤
(一)芽孢染色法
1．方法1
(1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。
(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。
(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5)用0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)复染lmin，水洗。
(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。
2．方法2
(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。
(2)加5%孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。
(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。
(二)荚膜染色法
1．石炭酸复红染色
（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。
（2）滴入1～2滴95%乙醇固定(不可加热固定)。
（3）加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。
(4) 在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，再以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。
(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。
2．背景染色
(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。
(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。
(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。
四、注意事项
1．荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。
2．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。
五、实验报告
(一)绘图
1．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。
2．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。
(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜?
七、问题和思考
1．为什么芽孢染色要加热?为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?
2．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?
3．试设计实验如何鉴定某一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。
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