肥达氏反应

【原理】

系以伤寒沙门菌H、O，肖氏沙门菌、希氏沙门菌H 为抗原，检测病人血清中相应抗体的定量凝集反应。

【材料】

病人血清、生理盐水、伤寒沙门菌“H”及“O”菌液，肖氏沙门菌、希氏沙门菌“H”菌液、小试管、32 孔(4×8)有机玻璃板，0.2ml 微量移液器及移液头。

【方法】

1．取32 孔有机玻璃板一块。

2. 吸取生理盐水0.8 毫升置于小试管中，然后加入0.8 毫升1:10 稀释的病人血清充分混匀，此时血清稀释为1:20。

3．取上述稀释的血清0.8 毫升，分别置0.2 毫升于有机玻璃板每排第一孔内.

4. 吸取0.8 毫升生理盐水，加于血清释释管中，混匀后，此时血清已被稀释成1:40。

5. 取1：40 稀释血清0.8 囊升．分别置0.2 毫升于有机破璃板每排第二孔内，以此类推，直至每排第七孔。

6．每排第8 孔不加稀释血清，加0.2 毫升生理盐水作为对照。

7. 加伤寒沙门菌“H”菌液0.2 毫升于第一横排各孔内(从第8 孔开始向前加，下同)；伤寒沙门菌“O”菌液0.2 毫升于第二横排各孔内；肖氏沙门菌 “H”菌液于第三横排备孔内；希氏沙门菌“H”菌液于第四横排各孔内。将有机玻璃板加以震荡，使菌液与血清充分混匀。置玻璃板于42℃孵箱半小时后观察结果，井记录凝集效价。

附录：

1．SS 琼脂培养基为分离肠道病原菌的强选择鉴别培养基。其组成成分包括：基础培养基、乳糖、枸橼酸钠，硫代硫酸钠、枸橼酸铁、中性红、煌绿和胆盐，其中基础培养基提供氮和碳源，乳糖在鉴别肠道致病菌和非致病菌上起重要作用，中性红为指示剂，它在酸性时呈红色，在碱性时呈淡黄色(PH6.8－8.0，，色调变更红橙黄)。一般肠道致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质，所以菌落呈淡黄色，大肠杆菌发酵乳糖时产生酸类，能使指示剂变红，所以菌落呈红色，中性红可为光线破坏，所以应将培养基保存于暗处，其余成分作为选择性抑制剂或缓冲盐。其中枸橼酸钠和煌绿对大肠杆菌的生长，菌体蛋白的合成和糖的利用，都有抑制作用，枸橼酸钠对致病菌无作用，枸橼酸铁对大肠杆菌无抑制作用，但能中和煌绿、中性红等染料的毒性作用。硫代硫酸钠能使大肠杆菌的红色菌落颜色鲜明。胆盐与构橼酸钠合用时，能加强对大肠杆菌的抑制作用。SS 琼脂培养基，对大肠杆菌的抑制作用很强，对肠道病原菌无抑制作用或抑制作用微弱，因此可以增加标本的接种量，从而获得对肠道病原菌较高的阳性分离率。

2. 克氏双糖培养基，下层为含葡萄糖的半固体培养基，可以观察细菌的动力和对葡萄糖发酵的能力，例如大肠杆菌能发酵葡萄糖产酸产气，所以下层变黄，且有气泡存在，同时有动力，细菌沿穿刺线向周围扩散生长。伤寒沙门菌则分解葡萄糖产酸不产气，有动力。上层为含乳糖及硫酸亚铁的固体，主要是观察细菌对乳糖的发酵情况及产生H2S 的能力，例如大肠道杆菌能发酵乳糖，所以上层斜面呈黄色，致病性肠道杆菌如伤寒沙门菌及痢疾杆菌等不能发酵乳糖，斜面不变色，大肠杆菌不产生H2S，故斜面无黑色；肖氏沙门菌产生H2S 则出现黑色。本培养基以酚红为指示剂，酸性时为黄色，碱性时为红色。

3. 伊红美蓝(Eosin Methyi Blue，EMB)琼脂平板为分离肠道病原菌的弱选择鉴别培养基。大肠杆菌发酵乳糖产酸，使伊红与美蓝结合成黑色化合物，显示出紫黑色菌落，周围有一层白环，病原菌不发酵乳糖，菌落透明无色。

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