1.涂片：(1)在洁净无油脂的载玻片上滴一滴生理盐水(如果是液体菌悬液,则可不滴)。(2)用灭菌接种环挑取菌落少许至载玻片的生理盐水内,并轻轻涂布成薄薄的菌膜。若是菌液标本,则用无菌接种针直接涂布成菌膜。 2.干燥：涂布的标本,一般在室温下自然干燥。
• 若需加速干燥，则可在酒精灯火焰上方利用其热空气加温,切忌火烤和温度过高。
3.固定：细菌固定常用的是火焰加热法
• 将干燥涂片迅速通过火焰2~3次,温度不宜过高,以玻片背面触及皮肤有热感而不烫手为度。
4.染色：染色的目的是增大标本与环境的反差，便于在显微镜下观察。
• 以普通涂片标本的染色为例,就是将所需染色液滴加在标本上，以覆盖涂膜为够，达到所需染色时间，倾去染色液，水洗，吸干即可。
5.媒染：有的染色还需要增加媒染剂。以增大染料与被检标本物质的亲和力，或使染料更好地固定于被染标本。
• 媒染剂可用于细菌标本固定之后，也可包含在固定剂或染色液中，革兰氏染色中的碘液就是媒染剂。
6.脱色：使着色的染料脱去颜色称为脱色。能脱色的物质称为脱色剂。
• 在染色中,使用脱色剂的作用有的是起溶媒作用,有的是影响细菌蛋白质的电离度，改变电荷的性质和数量，因而影响染料的染色质量。
• 利用脱色剂主要是检查染料与细菌结合的稳定程度，作为鉴定染色之用。如革兰氏染色使用乙醇，就是鉴别不同的细菌。
• 使用脱色剂时，就是将脱色剂滴在经过染色的标本上，作用一定时间后，倾去脱色剂，水洗即成。有的脱色一定要掌握好时间，否则不能达到理想目的。
7.复染：在进行鉴别染色时,已经进行过脱色的标本，常需要复染剂重复染色1次，使复染剂与初染颜色形成鲜明对比。复染不宜太强，以免覆盖初染颜色。
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