朊病毒的检测（下）
录入时间:2012-7-16 8:50:48
来源：百度文库
3 借助特殊仪器的检测方法
(1)电镜法：电镜检测瘙痒病相关纤维(SAF)是朊病毒检测的另外一种方法。现在认为PrPsc是SAF的组成成分。瘙痒病相关纤维为杆状、纤维状结构，其实是PrPsc在用去垢剂提取过程中，不同提取条件下形成的产物，感染生物体的组织切片中尚未发现SAF。基本步骤是：将被检组织置于10％N-laruoylsarcosine溶液中匀浆，差速离心、PK消化，重悬于蒸馏水中，负染，电镜观察。镜下可见两种瘙痒病特有的大分子纤维。电镜检查SAF灵敏度较低，不如免疫印迹方法。
(2)毛细管SDS-凝胶电泳：该法主要是通过理化方法--差速、超速离心，sodium N-lauroylsarcosine、PK处理，提纯PrPsc，然后在 Beckman P/ACE 5 500上进行毛细管SDS-凝胶电泳。根据各组分通过检测器时，在214 nm波长处产生吸收峰的时间和峰形，鉴别出瘙痒病病原因子PrPsc。该法标本用量少，无需免疫学试剂，判断直观；缺点是需用超速离心机、专用毛细管电泳仪。
(3)荧光标记肽链的毛细管电泳免疫测定法：该法是根据免疫竞争原理测定，采用无区带毛细管电泳技术结合免疫荧光技术，检测标本中微量的PrPse。其基本原理是将人工合成PrPsc特异性肽链(142～154)标记上荧光，然后与一定量的特异性抗体、羊脑提取物一起电泳，荧光标记的肽链与抗体结合后，迁移率发生改变，从而与游离的标记肽链分离开来，由于抗体的量只能结合大约50％的标记肽链，因而荧光标记的结合型肽链与游离型标记肽链的比例是固定的。当羊脑提取物中存在微量的PrPsc，由于其与标记肽链竞争结合抗体，导致结合型肽链与游离型肽链的比例发生改变，从而被仪器检测出来。该方法灵敏度很高，能检测到135 pg的PrPsc，可用于检测朊病毒水平很低的脑外组织(如血液等)。
(4)双色强荧光目标扫描法：该法是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术检测极其微量的朊病毒。其基本原理是利用致病性 PrPres，在适当条件下自我复制和自发聚集的特点，将重组PrP(rPrP)标记上绿色荧光，PrPres与正常构象的rPrP结合后，通过变构复制出大量的异常构象的rPrP盖。由于PrPres在一定条件下可自发聚集，从而使PrPres周围聚集了大量的rPrP盖，使其荧光强度超过游离的rPrP50倍。同时为了增强实验的特异性，又加入了标记上红色荧光的特异性单抗，使PrPres- rPrP盖聚集体又标记上红色荧光。只有同时发出高强度红、绿荧光的颗粒，才能被检测仪器判为PrPres。
目前，朊病毒领域的许多方面对人类来说还有一片空白或知之甚少，如朊病毒突破种属屏障传播的程度，通过生物制品和临床医疗传播的危险性，其他传播途径的探知，以及朊病毒致病机制的研究等等，诸多方面的问题都离不开朊病毒的检测，朊病毒检测方法的发展必将为朊病毒的研究开辟广泛的前景。
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