因为在接近中性的环境中细菌都带有负电荷，易与带正电荷的碱性染料结合，故常用碱性苯胺染料如美蓝、结晶紫、碱性复红等染色细菌。
（一）常用染料
1.碱性染料：电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌的等电点在pH2～5之间，在碱性、中性、弱酸性的环境中细菌均带负电荷，易与带正电荷的染料结合而着色。常用的染料有碱性复红、结晶紫、美蓝等。
2.酸性染料：电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。一般情况下细菌都带有负电荷故不易着色。如果降低菌液的pH使细菌带正电荷，则可被染色。酸性染料通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。
3.复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。
（二）常用的染色方法
细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）。
1.单染色法：用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色。细菌经单染色法处理后，可观察其形态、排列、大小及简单的结构，但不能显示各种细菌染色性的差异。
2.复染色法：用两种或两种以上的染料染色的方法，称为复染色法或鉴别染色法。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。
（1）革兰染色：本法是细菌学中最经典、最常用的染色方法。除粪便、血液等极少数标本外，绝大多数标本在分离培养之前都要进行革兰染色、镜检。
意义：①鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。甚至有时结合细菌特殊形态结构及排列方式，对病原菌可进行初步鉴定。②选择药物参考：G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性。③与致病性有关： 大多G+菌的致病物质是外毒素，而G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。
（2）抗酸染色：抗酸染色也可将细菌分为两大类：即抗酸性细菌和非抗酸性细菌。因为临床上绝大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检查项目，只针对性用于结核病、麻风病等的细菌检查。疑似结核分枝杆菌感染的标本，经抗酸染色后以油镜检查，即可作出初步鉴定。若查见红色抗酸杆菌，可报告为“找到抗酸分枝杆菌”。对临床疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。
3.荧光染色：荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。如痰标本涂片、固定，用荧光染料金胺O法（也称金胺O-罗丹明B法）染色，以荧光显微镜检查，在暗背景中可观察到呈金黄色荧光的菌球。
除以上所述染色方法外，用于细菌鉴定的还有鞭毛染色、异染颗粒染色等。
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