菌种的分离纯化技术——平板划线法

    划线的形式有多种，可将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线,第一区(A区)面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区(B、C区)是逐级稀释的过渡区，第四区(D区)，则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。为了得到较多的典型单菌落,平板上四区面积的分配应是D＞C＞B＞A。 

实验器材 

    大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合菌悬液 

    牛肉膏蛋白胨培养基 

    无菌培养皿，水浴锅，接种环等。 

实验步骤 

1．融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。 

2．倒平板：待培养基冷却至 50℃左右，按无菌操作法倒 2只平板(每皿约 15m1)，平置，待凝固。 

    倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管(瓶)塞(也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中)。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约 15m1，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 

3．作分区标记在皿底将整个平板划分成 A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约 60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使 D区与 A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。 

4．划线操作 

(1) 挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。 

(2) 划 A区：将平板倒置于煤气 （酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上， 仍留在煤气灯旁)， 右手拿接种环先在 A区划 3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完 A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。 

(3) 划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使 B 区转到上方，接种环通过 A区(菌源区)将菌带到 B 区，随即划数条致密的平行线。再从 B 区作 C区的划线。最后经 C区作 D区的划线，D区的线条应与 A区平行，但划 D区时切勿重新接触 A、B 区，以免极该两区中浓密的菌液带到 D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。 

5．恒温培养：将划线平板倒置，于 37℃ （或 28℃）培养，24hr 后观察。