微生物学实验室培养基的质量控制

    培养基在任何一个微生物实验室中都起到关键的作用，它广泛用于不同病原微生物的分离、鉴定和药物敏感性测定。大多数实验室经常自己制备培养基用于诊断和研究。但是为确保培养基的质量并能够提供令人满足的结果，适当的质量治理系统是必要的。为了这个目的，制备好的培养基在使用之前应检查几个参数。

    本文的目的就为确保培养基质量对需要考虑的参数及所需试验进行讨论，并根据需要评价的参数把培养基质控的程序分为几个部分。

    一、原材料参数

    培养基的质量直接依靠于用来制备培养基的原材料的质量。水是制备培养基最主要的原材料，需要检测的参数有铜离子的含量，导电性和pH。最理想的情况应该是水中不含铜离子，由于它抑制微生物的生长。导电性应该小于15μS(微西门子)。水的pH应偏酸，但是不能小于5.1[1]。

    倾倒培养基所用的带盖培养皿也是一个重要的因素。一般培养皿是经环氧乙烯(EtO)灭菌或是γ射线照射灭菌的。假如是用EtO灭菌的应该检测残余的EtO毒性，由于它可能影响微生物的生长。EtO可以用标准的气相色谱的方法测定，其最大的答应残余量为1μg/g。如使用玻璃器皿只可用硼硅酸盐的，由于碳酸盐玻璃可以将碱沥滤到培养基中。

    培养基的制备中还要用到很多添加剂，其中最重要的是血。所以血的质量对含血培养基的质量起至关重要的作用。在制备培养基之前应该小心检查血的无菌性、同质性、粘性和颜色。对于其它的添加剂，应该考虑分析的证实书和灭菌情况。

    二、灭菌参数：

    培养基灭菌在培养基的质量中具有重要作用。一般用自动高压锅进行培养基灭菌。但是，高压的时间和培养基的量要严格控制。复合培养基经热处理可能由于直接的热降解或者是成分之间的反应可能造成营养成分的丢失。所以优化加热过程把热损失降到最小是非常重要的。建议使用的循环是第1阶段：20～121℃，第2阶段：<100～121℃，第3阶段：121～121℃，第4阶段：121～80℃。

    一次消毒的培养基体积应较少，最好是2升。常规应用指示剂监测灭菌过程；温度和压力应该经常检测。可用灭菌指示剂如生物指示剂和Bowie Dick实验检查灭菌过程的有效性。可用生物指示剂如嗜热脂肪芽孢杆菌监测杀伤芽孢的效果。

    三、物理参数

    培养基的表面特征可表明质量的好坏。应该检查培养基的物理参数包括：有无过量的气泡或坑，培养皿填充是否均匀，培养皿中的培养基有无裂开、冰冻或结晶。

    所有上述提到的参数可以通过肉眼检查。但是培养基填充的均匀程度、培养基的厚度可以在4个点检查。这是4点是指培养皿两个成恰当的角度的直径的两个端点，这样可同时检测到四个面。记录4个点的厚度并计算均匀厚度。培养皿的厚度以均匀厚度表示，应该在4.0± 0.2 mm之内。

    培养基的pH值也是一个必须要检测的重要物理参数。可通过用标准的用标准液矫正过的pH计丈量制备好的待高压的培养基确定。

    四、微生物参数

    生长支持特性是培养基质控中最重要的参数，需要用标准的接种方法进行定性定量检测。并且在测定新的批号时，应该同时接种新批号和旧批号。

    临床实验室标准国家委员会（NCCLS）已经为各种培养基所用质控微生物的理想接种浓度和预期的结果列出了一些指导原则。每种培养基的接种可按如下方法预备：

    质控微生物接种于大豆酪蛋白消化(SCD)肉汤培养基中，孵育4小时获得相当于0.5个麦氏标准管的浓度的细菌。这种标准浓度的细菌悬液应该能获得107-108cfu/mL（625nm的吸光度为0.08～0.1）。选择性培养基和非选择性培养基应分别接种10uL 10倍和100倍普通生理盐水或SCD肉汤稀释的菌液。这些稀释的菌液用来评估价培养基的生长支持特性。每一种接种物做双份接种。接种后将培养皿放置在37°C 24小时，观察菌落的特性和生长特性。结果报告可在如下表格中填写有无生长以及生长特性。（见表1）

    　　实际上，尽对的微生物生长的测定或者耗时的或者需要特殊的仪器设备。菌落大小可以用来表明生长特性，但也是不敏感的指标。菌落特征的观察是主观的，且难以记录。

    　　像流行病学方法及可提供可比较数据的比例方法适合于常规的培养基微生物培养特性的质量控制，可用于检测培养基的生长和抑制特性。

    五、流行病学方法

    这是一种简单的数学方法。同时测定尽对生长指数（AGI）和相对生长指数（RGI）。这种方法基于将接种物不断划线直至细菌消失。这种方法可以用来比较不同批号的培养基也可以用来比较选择性和非选择性培养基。

    这种方法是将一满菌环的选定的实验菌株接种到5ml心脑浸汁肉汤培养基中孵育4小时。将含有培养基的培养皿分成4部分并按如图所示方法划线。

    用一个微升菌环挑一满环培养物并按A1, B1, C1, D1, A2, B2 .. 直到 D5的方法划线，中间不用烧菌环也不用再挑菌液。用同样方法在质控平板上操纵。孵育后记录测试板和质控板出现培养物的最后的点。这就是测试板和质控板的终点。这些结果可以用来计算培养基的AGI和RGI。AGI通过记录终点得到（见表2）。

    RGI是测试板和质控板AGI的比值。

    　 RGI随着培养基的用途而变化。为了检查有效性，RGI应接近100%。但是为了检测抑制性，RGI应接近0%。选择性琼脂的特性可以用一个用来测试分离特性的菌株和一个用来测试抑制特性的菌株进行测定。

    六、生产率(PR)

    测定培养基的生产率是测定代测培养基相对于质控培养基的特性的另一种方法，指控培养基应该是一种营养琼脂如胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)。所用接种物必须相同，PR通过计算测试和质控培养基上的克隆数得到。

    　　　　PR=测试板上的克隆数×稀释倍数

    　　　　质控板上的克隆数×稀释倍数

    　　这种方法是对Miles和Misra技术的改进。将测试用的培养物过夜培养，用缓冲蛋白胨水做10倍倍比稀释。将测试板分成4等份，并且每一部分标记好所用培养物的稀释倍数。（如图2）

    从高浓度开始，将相应稀释倍数的培养物放在相应的1/4圆内。并对质控板做同样的操纵。将每滴培养物在相应的1/4圆内涂布，并在37°C培养18小时。计数测试和质控板最低稀释倍数的克隆数。

    七、污染参数

    这也是决定培养基质量非常重要的因素，一批培养基在使用之前必须仔细检查污染情况。建议将一批制备的培养基在室温放3天以检查污染情况。或者从一批测试培养基中拿出两个放在孵箱内37°C孵育24小时。经必要的孵育后，检查有无生长。假如有生长，从同一批制备的培养基中再拿出两个，重复上述过程一次。假如再次出现污染，表明制备的这一批培养基有污染。建议当一批培养基污染超过10%应弃往。

   八、凝胶强度参数

    凝胶强度表明培养基中琼脂凝固的程度。凝胶强度通过一个三角架进行丈量，这个三角架中心有一个棒，用来给琼脂加压。这个棒的底端有一个圆形的部分，用来放在培养基表面。棒的顶端有一个平台，平台上可以放定量的砝码。中心棒的球形的部分放在培养基上，砝码一个一个地放在上面的平台上并观察一段时间。直到琼脂在中心棒的压力下断裂。计算琼脂的强度时须忽略中心棒的重量。中心棒施加在琼脂表面的压力可以通过下面的公式计算：Wpr2。公式中的w为放在平台上的砝码的重量，r为中心棒底端球形部分的半径。P=3.14。大约300-500dynes/cm2的凝胶强度是比较满足的。

        九、现状

    用于临床微生物实验室培养基的质控对从感染的病人体内获得正确的可解释的分离菌株是非常关键的。用标准的方法检测培养基可以节省时间和资源。最近在安大略湖质控应用情况的调查发现人们根本没有按NC CLS QA的建议往做。而且建议使用的ATCC菌株只有一半的实验室使用。培养基的批失败率在0.10%-9.87%之间（均匀1.01%）。失败的原因有不生长（39.9%），不抑制（18.6%），非无菌（17.9%），溶血（7.2%）和表面破坏（16.3%）。

    另外一项调查发现批失败率较小(0.5%)。Krisher等指出109个被调查的实验室中有41个使用50% 或更少NCCLS M22-A2提供的信息。在最近的NCCLS M22-A3文件中将培养基按质控失败率进行分类。失败率大于0.5%的培养基需要使用者做全部的质控，被称之为非免除培养基，如营养肉汤，Todd-Hewitt 肉汤, 麦康凯山梨醇琼脂, 含有IsoVitaleX 的巧克力琼脂, (r)Campylobacter血琼脂,含有5%羊血和环己酰亚胺的心脑浸液(BHI)。失败率小于或即是0.5%的培养基是免除培养基，建议只做最低限度的质控。可以节省本钱避免不必要的重复质控。

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