弯曲菌属的检验方法

1.增菌

A、碎牛肉

　　称取25g样品,置于匀质杯中,加入100mL增菌肉汤.用匀质器以8000-10000r/min匀质30s。将匀质液通过灭菌纱布,倒入250mL三角瓶中,于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

B、净膛全禽和分割肉

　　在一个灭菌容器中,用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min.肉汤经灭菌纱布过滤,于23000xg、4℃离心20min,或于16300xg、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

C、牛奶

　　称取40g牛奶放入离心管中,按2.条中方法离心.弃去脂肪和上清液将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。于微需氧条件下,35℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

D、贝类

　　将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中,用均质器以8000-10000r/min均质30s。用灭菌纱布过滤,取滤液50mL滤液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉汤, 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

E、河水或污水

　　取水样2-4升,每升水样加入5mL1M硫代硫酸钠,用0.45μm微孔滤膜过滤,立即将滤膜置

　　于100mL增菌肉汤中, 于微氧条件下,30℃预增菌3h后,再于37℃增菌2h,然后于42℃培养20-44h。

2.分离和初步鉴定

　　取5mL经20-44h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤.取经过滤和未经过滤的增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于二个平板.将平皿置于微需氧条件下42℃培养24-48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落.挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)显微镜检查,本菌呈快速螺旋运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,如小逗点状,两菌体的末端相连时,呈S形、海鸥形或螺旋状.挑取初步鉴定为弯曲杆菌的菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。

3.证实试验

　　从用作纯分离的平板挑选二个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于50mL三角瓶中的4mL布氏肉汤中,于微需氧条件下42℃培养24-48h.同时接种一份阳性培养物作为对照。通常用于生长试验和生化反应的基础培养物是含0.18%琼脂的布氏肉汤。该培养基分装于试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出接种物,滴加0.2-0.3mL于琼脂表面。

(1).生长温度试验

　　接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置于37℃培养,检查在这一温度下的生长情况,并用于观察过氧化氢酶反应。另二管分别置于25和42℃培养。每日检查有无生长。对未生长者,需培养5d方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长仅限于接近培养基表面的一薄层,广泛的生长不是弯曲杆菌属细菌所致。

(2).过氧化氢酶试验

　　滴加3%过氧化氢溶液于有细菌生长的试管中,产生气泡者为阳性反应。

(3).氧化酶试验

　　使用琼脂平板表面经24h培养的生长物.将氧化酶试剂滴于棉拭子上,用棉拭子接触生长物表面,接触点变为深蓝色者为阳性。

(4).硝酸盐还原试验

　　将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基中,置空气中于37℃培养5d.加入亚硝酸盐检测试剂,出现红色者为阳性反应。

(5).1%甘氨酸中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(6).3.5%氯化钠中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(7).硫化氢产生试验

　　将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。 置空气中于37℃培养.每日检查，观察滤纸条是否变黑，变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d,方可作出最后判断。

（8）.TSI试验

　　接种于TSI斜面，于微需氧条件35－37℃培养5d.空肠弯曲菌不产生硫化氢。所有弯曲杆菌属为碱性/碱性反应。

(9).麦康凯试验

　　将供试培养物接种于麦康凯培养基,于微需氧条件37℃培养3d,记录有无生长。

(10).马尿酸盐水解试验

　　用试管分装马尿酸盐水解培养基,每管0.4mL,冻存备用。将琼脂平板上培养过夜的生长物接种于1%马尿酸溶液中,振摇后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮试剂(将3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中),室温下放置2h,出现紫色者为阳性反应。

(11).抗生素敏感性试验

　　用灭菌棉拭子将预先准备好的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将头孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。于微需氧条件37℃培养24h,检查有无抑菌圈。

　　根据生化鉴定结果表对细菌作出鉴定。

附: 抗生素溶液

　　头孢哌酮钠（Sodium cefoperazone）:称取0.5g,用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存5天。

　　三甲氧卞氨嘧啶乳酸盐:称取0.66g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存1年。

　　万古霉素:称取0.5g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存2个月。

　　放线菌酮:称取1.25g, 用乙醇溶解后,用水定容于100mL容量瓶中。该溶液4℃保存1年。

　　每1000mL经灭菌的布氏增菌肉汤中加入以上4种溶液各4 mL。

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