从提纯病毒中分离病毒RNA

一. 目的

植物病毒中,绝大多数核酸为RNA,为研究病毒核酸组分结构及功能,首先要将病毒的核酸分离、提取。本实验即学习用酚-SDS法提取病毒RNA.

二.实验材料

     纯化TMV、CMV或其它病毒等.

三.实验用仪器及药剂

     高速离心机，真空干燥仪，微量取样器，1.5mL离心管
     抽取缓冲液(20mMTris-HClpH8.0；1%SDS；200mMNaCl，5mMEDTA)
     饱和苯酚/氯仿(1  ∶1)，氯仿/异戊醇(24  ∶1)，预冷100%和70%的乙醇，DEPC处理后灭菌蒸馏水。

四.实验步骤

  1.取适量病毒提纯液20～100μl,加灭菌蒸馏水至200 μl
  2.加入等体积(200 μl)抽提缓冲液
  3.加等体积饱和苯酚/氯仿(400 μl)，轻微振荡混合2-5分钟
  4.12000rpm离心2分钟
  5.取上清水相，再加等体积饱和苯酚/氯仿，混合抽提
  6.12000rpm离心2分钟
  7.加等体积氯仿/异戊醇(24  ∶1)抽提一次
  8.取上清水相加2.5倍体积无水冷乙醇，混匀、置-20℃下2小时
  9.12000rpm离心15分钟 
  10.倒去乙醇,沉淀用70%冷乙醇(0.5ml)洗涤2次 
  11.真空干燥,3～5分钟 
  12.沉淀溶于20 μl灭菌蒸馏水中,-20℃保存 
  13.取5 μl病毒RNA稀释到1ml,测O.D260，计算5 μl里RNA含量。

核酸、蛋白、病毒的浓度:

    1.核酸溶液:
      双链RNA或DNAO.D260 ≌1时为50 μg/ml(微克/毫升)
      单链RNA或DNAO.D260 ≌1.3时为50 μg/ml
      双链DNA浓度=[(G+(摩尔数)+14.19]/8.63≌1.7克/毫升
      RNA密度≌1.9g/ml

    2.蛋白质溶液:
      O.D280 ≌1.0时为1mg/ml
      含有核酸的蛋白质,其浓度(mg/ml)=1.5O.D280 －0.75O.D260　　　

    3.病毒:
                                          0.1%
     病毒浓度(mg/ml)=O.D260 ×稀释倍数/E1cm           260nm
     病毒产量(mg/kg)=病毒浓度×提纯总ml数×1000/组织重(g)

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