抗生菌的体外鉴别

1、了解抗生素产生菌体外筛选法的原理。

2、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。

原理

由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。

仪器与材料

1、培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装

4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。

2、试验菌：

（1）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

（2）大肠杆菌（Escherichia coli）

（3）金黄色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）

（4）深红酵母（Ruodotorula rubra）

3、待测菌株：

（1）琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株的编号。并按照编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomyces splendens）和金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）作为对照菌，28℃下培养7天。

（2）发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标记，28℃下振荡培养7天。

4、灭菌物品：培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。

5、其它：接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。

方法

一、琼脂块法

1、分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水制成菌悬液，备用。

2、取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右的细菌培养基，迅速在实验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个重复， 并注明指示菌及测定菌株的位置。

3、用无菌打孔器将待测菌株和对照菌的黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。

4、用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板的相应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。

5、静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。

6、用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。

二、滤纸片法

1、向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。

2、向已冷却至45℃左右的马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿背面标明测定菌株的位置，备用。

3、过滤各测定菌株的发酵液。

4、用无菌镊子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵滤液，放入指示菌平板的相应位置上，每1测定菌株3个重复。

5、静置20min后，28℃下培养2天。

6、用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。

结果

将实验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表示

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