布氏杆菌病细菌学诊断技术

    《WHO实验室生物安全手册》将布氏杆菌列为Ⅲ类危险级。布氏杆菌病是最容易实验室感染的疾病之一，当处理培养物和严重感染样品(如流产的材料)时要采取严格的安全预防措施。羊种布氏杆菌对人有高度致病性，是世界上最严重的人畜共患病之一。牛种布氏杆菌对人也具有高度致病性，实验室操作活的培养物或动物的污染材料是很危险的，必须在严格的生物安全三级或更高控制条件下进行，尽量减少职业暴露。处理大量布氏杆菌建议使用不低于生物安全三级的控制条件。职业性接触常致病，通常口、呼吸系统、结膜是主要感染途径，食人感染的奶制品构成主要的公共卫生危害。兽医和农民经常接触感染动物和流产胎儿或胎盘，存在很大的职业危险。

    1．样品收集与培养

    以细菌培养诊断动物布氏杆菌病时，样品的选择应以观察到的临床症状为依据。最有用的样品包括流产的胎儿(胃内容物、脾、肺)、胎膜、阴道分泌物(阴道冲洗物)、奶、精液、关节炎和水囊瘤液。死后采集样品的首选组织为网状内皮组织(如头、乳腺和生殖器淋巴结及脾)、怀孕后期或生产后早期的子宫、乳房。通常2-3天即可见有菌落生长，如无细菌生长也要培养8-10天才能认为是阴性而弃去。所有样品采集后应冷藏并立即用最快的方式运送到实验室。送到实验室时，奶和组织样品如不马上分离应冷冻保存。

    2．培养特性

    布氏杆菌为需氧菌，对营养要求严格，初代分离培养时，须在含肝汤、血清等营养丰富的培养基上才能生长。许多实验室在基础培养基(如血琼脂基础、哥伦比亚琼脂)中加入血清以促进某些布氏杆菌菌株的生长，如加入2％～5％的牛血清或马血清，则是牛种布氏杆菌2型生长所必需的。其他合适的培养基还有血清葡萄糖琼脂(SDA)、甘油葡萄糖琼脂。该菌生长缓慢，一般需要7一“天或更长时间才能长出肉眼可见的菌落。比较起来，羊种布氏杆菌生长最慢，猪种布氏杆菌最快，牛种布氏杆菌介于两者之间。多次传代后，不但生长变快(2-3天即可长出菌落)，而且对营养要求低，在普通培养基上也能生长。在血清肝汤琼脂上，形成湿润、闪光、表面隆起、边缘整齐的菌落。直径1～2mm。透射光下，菌落呈浅黄色有光泽，半透明。从上面看，菌落微隆起，灰白色。随时间推移，菌落变大，颜色变暗。光滑型(S)布氏杆菌在培养特别是继代培样时易发生变异而形成粗糙型(R)，菌落透明度降低、边缘粗糙、表面干燥、在折射光下呈暗白或黄色。变异检查操作简单，如用结晶紫染色，粗糙型菌落染成红色；而光滑型菌落染成浅黄色。如果菌落是光滑型的，则应用光滑型牛种布氏杆菌抗血清或最好用A和M表面抗原特异单价抗血清进行试验。若为非光滑型菌落，分离物应用布氏杆菌R抗原的抗血清进行测试。

    3．形态与染色

    该菌初次分离培养时多呈球杆状，牛布氏杆菌、猪布氏杆菌经传代培养渐呈杆状，羊布氏杆菌则不变。布氏杆菌多为长0．6-1．5gm，宽0．5-0．7／zm的球杆菌或短杆菌。它们多单独存在，很少成对或成团。布氏杆菌无鞭毛不运动、无菌毛、无芽孢、不形成真正的荚膜。布氏杆菌革兰染色阴性，一般不发生两极着染。用改良Ziehl-Neelsen方法染色，布氏杆菌菌体染成红色，背景为蓝色。

    4．生化特性

    该菌分解糖类的能力因种类而不同。一般能分解葡萄糖产生少量酸，不能分解甘露糖，不能产生靛基质，不液化明胶，不凝固紫乳。VP试验及MR试验均阴性。有些菌型能分解尿素和产生H2S。 

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