液芯包囊化清酒乳杆菌增殖培养基的优化（1）

关键词：液芯包囊；清酒乳杆菌；乳清粉；增殖培养基；响应曲面法  

直投式发酵剂加工发酵乳是当今发酵乳工业化生产的发展方向。发酵剂的质量将直接影响发

酵乳的品质，而高浓度菌体的获得又是研制高效浓缩型发酵剂的关键。传统的乳酸菌培养采用游离细胞悬浮培养，生产效率低，细胞密度低， 细胞分离难，成本高。 包囊化乳酸菌避免了传统发酵剂的缺点和限制，细胞密度可达到10¹⁰ cfu／g以上，从培养基中分离细胞不需经过超滤或冷冻离心，而用普通的过滤就可进行，因此大大降低了生产成本。无论采用何种技术和方式来生产高效浓缩型直投式发酵剂，都必须首先获得使乳酸菌能够大量生长的增菌培养基。适合工业化生产的乳酸菌培养基必须基于原料易得、 价格低廉、 菌体产量高^［2］。  

乳清是乳品工业的副产品，主要成分为乳糖，还含有蛋白质及无机盐等成分。 必需氨基酸、 矿物质和B族维生素的含量也较丰富l   3 l 。本研究以乳清粉为基础培养基，补充适当碳、氮源，促生长因子，pH缓冲剂，用于自发酵肉中分离的清酒乳杆菌包囊化高密度培养。   

1材料与方法

1．1实验材料

1．1．1供试菌株

清酒乳杆菌 ( Lactobacillus sake L．S—MA 3一l0)，本实验室分离和保藏。   

1．1．2培养基

菌种活化培养基：MRS培养基^［4］。 

活菌计数培养基：MR S培养基。

细胞增殖基础培养基：乳清粉6％，葡萄糖2％，酵母粉2％，CaCO₃ 0．5％，MgSO₄  0．028％， MnSO₄ 0．005％。 

番茄汁的制备：将新鲜番茄洗净，切碎，放人三角烧瓶，置4℃冰箱 8一l2h，取出后用纱布过滤即成。

胡萝卜汁的制备： 将新鲜胡萝卜洗净，切碎，加等量水煮沸 20—30main， 离心收集上清。

1．2实验方法

1．2．1液芯包囊的制备^［5,6］ 

将甘油管保存的菌株L．sake 用MRS液体培养基活化两次，发酵液离心收集菌体，加入少许生理盐水悬浮菌泥，再倒入1．5％ (w／v )CaC1₂ 溶液与0．3％(w／v ) 黄原胶溶液的混合液中制成菌悬液。  

将菌悬液置入已灭菌的l0 mL注射针筒中，逐滴滴入磁力搅拌的0．8％ (w／v) 海藻酸钠溶液中(含 0．1％吐温一80)， 所形成的液芯包囊过滤后用生理盐水洗涤， 转移到2％ (w／v)CaC1₂溶液中硬化处理1h，然后将过滤并用生理盐水洗涤过的包囊置于0．3％(w ／v ) 壳聚糖溶液中，在定轨摇床上轻微摇30min，最后生理盐水洗涤，收集包囊。 

1．2．2液芯包囊清酒乳杆菌的增殖培养

按实验设计 配制培养基，108灭菌 2 0mi n，冷却后，以l％(w／v )的固定化包囊接种， 置摇床内，转速为80r／min，37℃培养20h后，过滤进行包囊内细胞计数。   

1．2．3囊内细胞计数用^［7］ 

无菌称取1g包囊，放入99mL灭菌的柠檬酸钠溶液中(1％( w／v )，pH 6．0)，待包囊完全溶解后，用无菌生理盐水逐级稀释后进行平板计数。 

1．3实验设计

1．3．1单因素实验设计

将不同的碳源、 氮源、 促生长因子及不同浓度的pH缓冲剂CaCO₃分别添加到培养基中，按1％的接种量放入包囊化清酒乳杆菌，调节起始pH，在一定温度下培养一定的时间，进行囊内细胞计数。  

1．3．2响应曲面实验设计

在单因素试验基础上，确定包囊化清酒乳杆菌增殖的生长强化因子，采用响应面分析寻求多因素系统中培养基组分的最佳优化条件。      

本实验采用旋转中心组合设计（Central Composite Rotatable Design， CCRD ) 法， 选择葡萄糖、蛋白胨、番茄汁以及CaCO₃ 四个因子为研究对象，以菌体浓度为响应值，设计试验，对实验数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值。

本阶段实验辅助软件为Design Expert 软件(Version6．0．10，Stat - Ease．，Minneapolis，MN．USA)。实际考察的变量及其实验编码见表1。

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