甘草有益微生物的研究进展

【摘要】  植物体内大量分布的微生物对植物产生的影响已成为人们关注的热点，特别是那些有益的影响可对植物的生长及活性成分的形成产生一定的作用。甘草作为一种大宗中药，其栽培品的质量一直是人们所关心的问题，甘草有益微生物对提高甘草的品质有重要作用。该文综述了甘草有益微生物的研究进展，以期对提高栽培甘草的质量起到指导意义。

【关键词】  甘草; 内生菌; 根瘤菌; 菌根真菌

甘草是豆科甘草属(Glycyrrhiza)植物，其根及根茎为常用中药，市场需求量大。近年来，随着野生甘草资源的急剧减少，且国家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖锐。在这种情况下，对甘草资源的保护性利用及栽培甘草势在必行。近年来，随着人工甘草种植面积的逐年加大，提高甘草的质量成为亟待解决的一个关键问题。相关研究表明，植物有益微生物可以产生促植物生长的活性物质，提高植物固氮性能，促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄主植物健康生长。因此本文就近年来甘草有益微生物的研究进展进行综述，以期对提高栽培甘草的质量有指导意义。

　　1  甘草内生菌的研究现状

    内生菌是指一生或至少一生中的某个阶段能进入活体植物组织内，并且不引起明显组织变化的真菌或细菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt的树皮中分离出二百多种微生物，其中有一株内生真菌Taxomyces andreanae能产生紫杉醇，这一研究结果引起学者对内生菌的广泛兴趣。目前，人们已经从长春花、千层塔、银杏、厚朴等多种植物中分离得到了内生菌，并取得了一些成果。

    有学者对甘草内生菌也进行了研究，发现内生菌对甘草产生一系列作用。宋素琴等［4］对采自新疆的健康野生胀果甘草不同组织中的内生菌进行分离，并纯化得到149株细菌和2株真菌，鉴定得出149株细菌分属于13个属，2株真菌分属于青霉菌属Penicillium和镰刀菌属Fusarium。有学者发现内生菌可通过拮抗病原菌促进甘草生长。饶小莉等［5］从乌拉尔甘草健康植株的根茎叶中共分离到内生细菌98株，并采用平板对峙方法筛选出6株菌株，其对植物病原菌有明显体外拮抗活性，鉴定这6株拮抗菌株分属萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Paenibacillus ehimensis。龚明福等［6］采用无菌操作技术从野生健康甘草Glycyrrhiza uralensis的根、茎、叶、种子、根瘤等组织中分离出内生细菌（Endophytic bacteria)125株，其中31株对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)具有较强的拮抗活性，这31株内生细菌分属于气芽孢杆菌属(Aerobacillus sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单孢杆菌属(Xanthomonas sp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)。另有研究发现，从甘草中分离的有些内生菌还可产生活性物质。韦革宏等［7］从乌拉尔甘草和光果甘草中共分离得到68株内生菌，从中筛选出一个来自乌拉尔甘草的菌株Mesorhizobium sp. CCNWGX022，从该菌株发酵液的石油醚提取物中分离得到了十八烷酸内酯Rhizobialide，是第一次从内生菌中得到此类物质。另有学者研究了内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量变化趋势。林世利等［8］分离出不同月份苦豆子、骆驼刺、苜蓿、铃铛刺、甘草不同部位的内生细菌，研究阿拉尔地区豆科植物内生细菌种群动态。结果显示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的铃铛刺和骆驼刺植株的内生细菌的种类最多。内生细菌种类的分布规律依次为苦豆子中叶＞茎＞根＞种子＞花，苜蓿中根＞叶＞茎＞花＞种子，铃铛刺中茎＞叶＞种子＞花＞根，骆驼刺中根＞茎≥叶＞种子＞花，甘草中茎＞根＞叶＞种子＞花。5种豆科植物生长期中总带菌量平均值在各个月份变化趋势不同，并且各个月份的带菌量处于交替变化之中，说明不同月份5种豆科植物内生细菌的种类和数量不同，同种豆科植物不同组织部位的内生细菌的种类和数量有差异。

　　2  甘草根瘤菌的研究现状

    根瘤菌是与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有很强的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生两种类型，为化能异养菌。目前有学者已经从甘草中分离得到根瘤菌并进行了一些相关研究。

    目前对甘草根瘤菌的研究多体现在根瘤菌的分类上。杨雪颖等［9］通过对西北干旱半干旱地区68株甘草根瘤菌的表型多样性和抗逆性分离研究，发现1个新类群和1个具有较高抗逆性的菌株。对新类群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035进行16SrDNA全序列测定及系统进化研究。结果表明，CCNWGX022和CCNWGX035与中慢生根瘤菌属内参比菌株的16SrDNA相似性分别大于96.8％和98.3％，判定它们均属于中慢生根瘤菌属。谷峻等［10］采用表型数值分类、16S rDNA PCR-RFLP分析和BOX-PCR指纹图谱分析的方法对中国北方地区的甘草根瘤菌进行表型、遗传多样性分析。供试菌株在数值分类聚类分析中约85％的相似水平上产生2个表观群，有11株菌未与已知参比菌株聚群。16Sr DNA PCR-RFLP分析表明，供试的20株菌共产生14种遗传型，表现出丰富的遗传多样性。BOX-PCR指纹图谱分析进一步证明与甘草共生的根瘤菌的基因组也具有多样性。由此得出结论：在中国北方地区与甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium属中均有分布。

　　3  甘草菌根真菌的研究现状

    菌根是土壤中某些真菌与植物根的共生体。凡能引起植物形成菌根的真菌称为菌根真菌，大部分属担子菌亚门，小部分属子囊菌亚门。菌根真菌与植物之间建立相互有利、互为条件的生理整体，并各有形态特征，这是真核生物之间实现共生关系的典型代表。根据形态和解剖学的特征，又把菌根分为外生菌根和内生菌根两大类。有学者对甘草菌根真菌进行研究发现菌根真菌可促进甘草的生长。饶小莉等［11］分离了甘草的VA菌根，并用三叶草进行单孢繁殖，将繁殖后的菌根真菌回接甘草，结果发现接种了菌根真菌的甘草植株笔长、根粗、茎叶干重和根干重都有较大程度的提高，均比对照显著增加，并且不同处理对植株生长影响不同，得出结论接种VA菌根真菌显著促进了甘草的营养生长。Jingnan Liu等［12］用两种AM菌根真菌Glomus mosseae与Glomus versiforme接种甘草，结果显示接种的甘草相对于对照组在生长的早期和晚期有显著提高，叶摄取磷的量比对照组多，并且根中甘草酸的浓度有所升高，但根部氧化酶活性相对降低了，由此得出结论接种AM菌根真菌有可能成为提高甘草药用价值的有效途径。

    4  甘草其他微生物学相关研究现状

    近年来，对甘草微生物学转化等方面的研究工作也取得了一定成果。谢毛成［13］利用发根农杆菌的Ri质粒，以光果甘草种子胚萌发形成的实生苗不同部位为外植体，成功诱导出光果甘草毛状根，并利用TLDNA中rolC序列中的特异性引物，应用PCR技术对光果甘草毛状根进行了分子水平的鉴定，并利用理化手段对毛状根转化后产生的冠瘦碱进行了薄层定性鉴定，从不同水平上证实了光果甘草毛状根核基因组中已整合了外源Ri质粒的T-DNA片段。燕飞等［14］利用发根农杆菌R1601对药用植物胀果甘草(Glycyrrhiza inflat Bat)进行转化，诱导其产生发根。在发根诱导过程中，分别用不同菌液浓度、不同浸染时间对胀果甘草子叶、胚轴进行转化处理，统计、比较各条件下的发根率，结果表明，用稀释2倍的菌液浸染子叶8 min时，发根诱导率最高,为56.49%。何晨等［15］用一株产β-葡糖醛酸酶的菌种HC-12对甘草进行液体发酵转化。通过对菌种复合诱变以及应用系统数值化及灵敏值系统调控技术优化了发酵工艺，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。经过柱层析及HPLC及1H NMR鉴定分离得到了甘草次酸纯品，并通过动物实验验证了发酵甘草于未发酵的生品对照甘草具有抗炎活性和镇痛作用显著性效果。

　　5  小结

    内生菌对甘草的有益作用体现在：①内生菌有促进甘草生长作用，内生菌可与病原菌竞争营养或直接产生拮抗物质而抑制病原菌，从而促进甘草生长。②有些内生菌可产生活性物质。③内生菌在甘草不同部位及不同月份的数量呈现一定的变化趋势。另有研究表明，内生菌能产生与宿主相同的活性物质［3］，王兴红［16］推测内生真菌可能与中药的道地性有密切的关系。这些成果对于甘草内生菌的研究有重要意义。

    根瘤菌对甘草的有益作用体现在：根瘤菌能够通过与甘草共生，引起甘草根部或茎部结瘤，将空气中的N2转化为可吸收利用的NH4，从而为甘草提供氮素营养，促进其生长。

    菌根真菌对甘草的有益作用体现在：甘草和菌根真菌是一种互惠共生的关系，它们之间可以交换各自所需的物质，甘草借助菌根真菌吸收水分、养分和生长促进剂，而菌根真菌也从甘草中摄取自身生长所需要的糖分和其它有机物。菌根真菌是根系的延长和扩展，且比根系吸收水分、养分的能力大得多，可促进甘草的营养生长，提高甘草的药用价值。

    微生物转化对甘草的作用体现在：对甘草进行微生物转化，可提高其有效成分含量，用药效果可得到提高。

    总之，微生物是个潜力巨大、尚待开发的资源，对甘草相关微生物进行研究有重大意义，有利于提高甘草的质量，对于中药的可持续发展也将起到重大作用。

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