兽医诊断细菌学检查

当怀疑发生细菌性传染病时，最可靠的诊断依据就是检查病原性细菌，并对其进行分离、培养及鉴定。 

　　1.病料的采取作细菌学检查用的病料应选取发病后未经药物治疗的、自然死亡不久或濒死期动物的新鲜病料。一般取肝、脾、淋巴结和血液，也可根据具体情况选取特殊病料，如梭菌性肠炎可取小肠内容物，链球菌性关节炎和脓肿可取关节液和脓汁，布氏杆菌病可取流产胎儿或胎衣、胎液，传染性鼻炎、鸡传染性鼻炎和慢性呼吸道病可取眼、鼻及眶下窦分泌物等。采取的病料若不能马上作检查或须往外地送检，则应放在含30%甘油的灭菌生理盐水中于4℃左右保存，并不超过72小时。病料采取过程中应严格无菌操作，避免污染杂菌，同时也防止污染环境或自身感染。 

　　2.涂片镜检病料若为实质脏器如肝、脾及淋巴结等，则剪下一块，用其新鲜切面涂在载玻片上;若为液体病料如血液、腹水等，则取一滴直接加在载玻片上均匀涂开;若为较黏稠的脓汁、粪便等，则先在载玻片上加一滴蒸馏水，再取少量病料放于其上混匀并涂开。涂好的病料片子自然干燥后在酒精灯上火焰固定，然后染色。细菌载玻片染色的方法很多，常用的有美蓝染色法、革兰染色法、瑞特染色法、姬姆萨染色法等。目前这些染色液均已商品化，在各大医疗器械试剂商店均可买到，并附有使用说明，按其说明操作即可。染色结束后让载玻片自然干燥，再于光学显微镜下用油镜头进行观察，根据观察到的细菌形态特征可作出初步判断。 

　　必要时进一步作分离培养。 

　　3.分离培养细菌的分离培养可分为有氧培养和厌氧培养，前者即在有空气的自然条件下进行，后者则需在人工造成的特殊厌氧条件下进行。最好的厌氧条件是二氧化碳培养箱，但价格昂贵，因此一般常用简便的厌氧培养方法，如烛光法(将培养物放入一个能密封的容器中，在容器中点上蜡烛，密封容器，待氧气耗尽蜡烛自然熄灭即可)和液体石蜡法(在液体培养液上加一层液体石蜡，使培养基与空气隔绝)等。按培养基的性质可分为固体培养和液体培养，前者是将各种营养成分与琼脂共同融熔后倾注平皿，待其冷凝后用作细菌培养;后者则是以牛肉汤为基础，加入所需要的其他营养成分即可。分离培养不同的细菌需用不同的培养基和方法，但一般来讲常见病原菌都能在普通琼脂平板、鲜血琼脂平板和　　普通肉汤培养基上生长。另外，还有用于鉴别不同细菌的鉴别培养基如麦康凯琼脂、伊红一美蓝琼脂及其他特殊培养基。目前几乎所有培养基都已有商品化成品在各地医用试剂商店出售，不需像以前那样自己配制，需用时买回来按说明书简单处理后即可使用，非常方便。 

制备培养基所用的玻璃平皿、试管、吸管等物品应用纸包扎密封后在干燥箱中160℃干烤灭菌2小时;培养基则应在高压蒸汽灭菌器中121℃灭菌30分，特殊培养基则按其具体要求进行高压蒸汽灭菌。液体培养基一般是先分装入试管，密封后再高压灭菌，冷却后可直接使用。固体培养基一般是先高压灭菌，待冷却至50℃左右时快速倾注平皿成为琼脂平板，或分装入干烤灭菌的试管中制成琼脂斜面。整个操作过程均应在超净工作台或无菌罩中进行。制备好的培养基密封后于4～10℃可保存1～2周。 

　　分离、培养细菌也应在超净工作台或无菌罩内进行。用一手套刀片或钢锯条在酒精灯上加热后于病料表面烧烙一T，然后用剪刀在烧烙面上开一小口，用火焰消毒过的铂金耳(也叫接种环)插令切口深部，勾取少量病料组织在琼脂平皿中划线接种，或接种肉汤培养基。若为液体或半固体病料，则直接勾取病料接种培养基上即可。然后根据需要以需氧或厌氧条件在37℃培养18～24小时。观察有无可疑菌生长，并记录细菌的生长特征。勾取少量细菌涂片、染色、镜检，观察所分离细菌的形态特征以协助分析。若对所分离细菌不易作出鉴定，则需进一步作生化鉴定、血清试验及动物试验等。一般当用显微镜不易直接从病料中检出细菌时，分离培养却能检出，因此分离培养对细菌的检出率高于镜检。 

　　4.生化试验许多细菌在培养特性、形态特征上非常相似，有时很难区分它们，这就需要依靠生化试验来作出鉴定，因为不同的细菌对营养成分的利用及其形成的代谢产物有显著差异。最常用的生化试验有糖发酵试验、靛基质试验、硫化氢试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验等。另外，各种鉴别培养基本质上也都属于生化试验，反过来，各种生化试验培养基也都是鉴别培养基。生化试验一般需观察24～72小时，而且目前多为微量试验，均有成套反应管出售，从各大医用试剂商店买回即可使用，简便可靠。作生化鉴定用的细菌必须经过纯化即纯培养，否则结果不可靠。生化反应管买回后将纯化的细菌直接接种进去，37℃条件下培养、观察并记录结果，最后根据结果作出判定。 

　　5.药敏试验在传染病的诊治过程中，有时虽然已分离、培养出细菌，并确诊出是什么病，但使用药物后治疗效果并不理想。这是因为目前抗菌药物的种类很多，而不同细菌或菌株对各种药物的敏感性差异很大。同时由于长期以来抗菌药物的广泛使用以及一些不合理的用药导致了大量耐药性菌株的产生，这就　　使得人们不得不进行药敏试验。药敏试验的原理和方法都很简单，即当细菌接种到培养基上进行培养时，分别加入一定浓度的不同抗菌药物，然后观察培养结果。哪种抗菌药物能抑制细菌的生长，它就是敏感药物，或者说该细菌对这种药物敏感;反之则说该细菌对这种药物有抗性，也叫耐药性。最常用的药敏试验是纸片　　法。将欲测试的抗菌药物按规定浓度稀释后浸泡直径4毫米的圆形滤纸片，无菌晾于或烘干后即可使用。目前医药试剂商店已有各种商品化药敏纸片出售，买来即可使用，非常方便。实验时先将细菌纯化培养，然后挑取少量纯培养物划线接种普通琼脂平板。 

　　将不同的药敏纸片分散均匀放在接种过细菌的琼脂平板中，加盖后37℃培养18～24小时观察结果。细菌对哪种药物敏感，哪种药敏纸片周围就无细菌生长，形成一个空白区，此区称为抑菌圈。 

　　细菌对药物的敏感性是以抑菌圈直径的大小来判定的，每种药物都有其判定标准。

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