2.1 产脂肪酶天然菌株的筛选
经过初筛、复筛培养，分离出4株活性较高菌株，经过法国梅里埃微生物鉴定仪鉴定，2株为霉菌，1株为适应弱碱性环境的金黄色葡萄球菌（见图1A，1B），1株为蜡样芽孢杆菌。经过富集、初筛、复筛等过程，用溴甲酚紫平板从富含油脂的土壤中筛选得到产脂肪酶的菌株，大部分酶活力经测定后在20 U/mL以内（见表2）。并对其中的4株的酶学特性做了初步研究，4株的作用温度都较高，在42 ℃左右，一株为产弱碱性脂肪酶，另3株为产弱酸性脂肪酶。
2.2 天然菌基因组提取的优化
所提供的三种提取方法提取全基因，提取效果见图2。泳道1和3试剂盒法、酚-氯仿法所提取DNA电泳条带清晰，泳道2煮沸法提取DNA电泳条带几不可见，表明试剂盒法、酚-氯仿法方法提取的DNA得率较高，煮沸法提取的DNA得率较低。
2.2 脂肪酶基因的克隆与鉴定
不同方法提取细菌基因组后的PCR扩增电泳见图3泳道1～3，表明泳道1试剂盒法最佳，泳道2酚-氯仿法次之，泳道3煮沸法提取的基因组模板的PCR产物出现拖尾现象，可见该方法导致基因组降解较剧烈，完整目的基因也因此保留较少。图3泳道4，为质粒提取试剂盒提取细菌总质粒为模板的PCR产物，无任何扩增条带出现表明该菌脂肪酶基因位于染色体基因上，质粒不携带脂肪酶基因。克隆工程菌重新提取重组质粒，重组质粒用NcoI，XhoI双酶切后得到脂肪酶基因大小约为900 bp，与预期结果一致，见图4。
2.3 测序结果分析
通过Blast比对分析，没有找到与之完全匹配的序列。测序结果与GenBank注册号EU310372的序列同源性较高。测序结果表明有10处碱基变异，导致三处氨基酸发生改变，即56位由缬氨酸变为精氨酸，183位由亮氨酸变为苏氨酸，287位由组氨酸变为谷氨酰胺（见图5）。
2.4 脂肪酶结构预测分析
运用DNA star 7.1软件分别对两个脂肪酶蛋白的二级结构进行分析，比较了各类氨基酸数目，螺旋（H=helix）、折叠(E=extend/sheet)、转角(L=loop)结构的出现的频率（见表3），虽然有一定的变化，但经SPSS 11.0统计学软件对两组酶相应结构类型进行配对t检验统计，无显著性差异（P >0.05)。图6中箭头所示为标准序列（A）与克隆脂肪酶氨基酸序列（B）第56位氨基酸发生突变位点导致亲水性的显著提高，183位及其287位氨基酸突变对亲水性的影响不显著。
3 讨论
3.1 高产酶菌的筛选及其鉴定
由于含有脂肪酶基因的细菌会进行油脂分解代谢，在高油脂环境中的细菌相应的脂肪酶基因也会有较高的活力及其表达量，故我们选取长期富含油脂的土壤标本分离细菌，这样可以最大可能地保证待筛选菌株含我们所需高活力脂肪酶基因。实际采集中，从餐饮店后方的清洗处的土壤中分离到较多种类的细菌，结合微生物学对细菌形态描述与菌种鉴定，其中就含有多株产高活力脂肪酶的菌株包括葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、霉菌等。
3.2 脂肪酶基因克隆及酶活力测定
根据GenBank中提交的各类脂肪酶基因，设计引物的数量大于分离到的菌株数量，对分离到的菌株进行不同引物条件的扩增，提高了获得脂肪酶基因的可能性，达到预期的目的，得到脂肪酶基因。
在提取微生物基因组中我们开始时采用煮沸法。该法操作简便，成本也很低，但是其基因组得率低，经PCR扩增后得不到产物，尤其对细胞壁较厚的金黄色葡萄球菌等扩增效果不理想，其原因可能是提取的DNA产物不纯，混杂有许多蛋白质，导致后续的PCR扩增无明显结果。因此，试验中先后采用了基因组提取试剂盒和酚、氯仿方法提取基因组取得了较好的效果。用基因组提取试剂盒提取的DNA得率及其纯度都较高，但是成本较高。酚-氯仿法是试验中常规的一种提取细胞染色体DNA的方法，成本较低，但是步骤繁琐，耗时很长，DNA经过多种有机溶剂多次抽提损失较大且易被污染，试剂的有效与否也会产生影响，而且酚和氯仿都对人体有一定的危害[10]。
3.3 克隆脂肪酶二级结构变化讨论
克隆脂肪酶的三处氨基酸突变可能是筛选出含该天然酶细菌活性提高、耐受40 ℃高温以及在高油脂环境依旧水解脂肪的重要原因。而克隆的脂肪酶三处突变导致的结果是亲水性的显著提高，可能有利于提高该酶对脂肪的水解率。
对产脂肪酶的天然菌的分离过程由于是在暑期进行，土壤中油脂来源于生活生产的废弃用油，沉积过程中油的温度可高达60 ℃以上，那些不耐高温且脂肪利用率低的细菌死亡，仅耐高温且产脂肪酶活力高的菌株得以生存。在这种高温、高油脂的外界压力筛选下，微生物的脂肪酶基因极有可能发生突变以适应周围环境。
本实验从细菌中克隆的脂肪酶基因经过BLAST比对后无完全相同基因型，极可能是该微生物在高油脂环境的压力下，其脂肪酶基因发生突变导致其脂肪酶活力的提高，以便于更好利用这一营养物质而能生存下来。后续的研究中我们将进一步在原核表达系统中验证所分离的脂肪酶基因具有高活力，从而获得具有较高热稳定性及其活力的脂肪酶用作各种产品的添加剂及其催化剂。
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附：天然高产脂肪酶细菌的分离鉴定及脂肪酶基因的分析（上）-点击查看
