质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测（上）

一、碱变性法提取质粒DNA

质粒(Plasmid)是细菌染色体外能自身独立复制的双股环状DNA。带有遗传信息，可赋予细菌某些新的表型。将质粒指纹图谱分析方法、质粒 DNA探针技术及检测质粒的PCR技术用于临床感染性疾病的诊断和流行病学调查已成为现实。质粒作为载体在基因工程中起着重要的作用。

分离和纯化质粒DNA的方法很多,但这些方法基本包括三个步骤：即细菌的培养和质粒DNA的扩增；细菌菌体的裂解;质粒DNA的提取与纯化。

本实验学习用碱变性方法提取质粒DNA 。

【原理】

细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后，菌体裂解，可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来，经琼脂糖凝胶电泳，因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭（EB）染色后，在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。

【材料】

1、菌株E.coliJM109（pUC19），E.coliRRI（pBR322）

2、试剂溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)
      溶液II(0.2NNaOH，1%SDS)用前新配制
      溶液III(5mMKAc溶液，PH4.8)
      TE缓冲液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA，PH8.0)
      LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g,Nacl10g，加蒸馏水溶解，用NaOH调PH至7.5，加水至1000ml，15磅高压灭菌15分钟。)

【方法】

1、接种细菌于5mlLB液体培养基中，37℃培养过夜。

2、3000rpm/min,离心15min，弃上清。加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。

3、加入200ul前新配制的溶液II，颠倒EP管5次混合均匀，置冰浴2min。

4、加入150ul溶液III温和地混匀，12000rpm/min,离心5min。

5、吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次，12000rpm/min,离心2min。（若不做酶切，此步可省略）吸取上清放入另一新EP管中，加入二倍体积的冷乙醇，12000rpm/min,离心10min。

6、弃乙醇，干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸，待电泳检测。

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