植物组织培养知识概要（四）

★花药培养方法：

取材地点：大田和温室

取材：大多采用单核期的花粉培养，因诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。

花粉时期的确定：常采用醋酸洋红-碘化钾染色，再压片镜检。实际操作中常根据花蕾长度、大小与花粉年龄的相关性确定。

预处理：低温、高温或交叉处理

培养基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低浓度的生长素和细胞分裂素相结合，高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定作用。培养基中加入活性炭对提高诱导频率也有一定效果。

消毒、接种和培养：花药→在烧杯中研碎（有溶剂）→过滤→浓度梯度离心→收集中间层→离心

单倍体的鉴定和加倍处理：单倍体用2％秋水仙素处理24小时，愈伤组织细胞自然加倍。

★花粉花药培养的意义：1、在单倍体细胞中只有一个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。2、在品种间杂交育种过程中，通过F1代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比，显著缩短了育种年限。

★花药培养步骤（用改良的NLN培养基）：

F1代花药→形成小孢子→分离小孢子→形成愈伤组织→形成胚→单倍体植株→纯合二倍体

                      ↓

                    形成胚→单倍体植株→染色体加倍形成纯合二倍体

★原生质分离：酶（纤维素酶，离析酶）

步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。

★原生质体的培养：

  培养基：MS＋NAA 2.0ppm＋BA 0.5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇

  注意：1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。

        2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。

  影响原生质体培养的因素：营养需求（NH4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/mL），

                          贮藏条件（通常在黑暗处）。

  培养方法：液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。

  固体培养的步骤：原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细   

胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。

★原生质体分离培养的意义：1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。

★原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。

★体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。

★原生质体融合方法：自发融合，诱发融合（NaNO3处理，高PH-高浓度钙离子处理，PEG处理，电融合）

  PEG法：

取材（1、从绿色叶片上分离得到的原生质体。2、来源于同种或不同种的细胞悬浮培养物上分离出的无色原生质体）－这样异核体和母体就可分辨开。

→分别取在含有13％甘露醇的CPW上悬浮培养的原生质体（密度2×105）4mL，混和在100g的转速下离心10min，将原生质体放入0.5％基质→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生质体的外膜不稳定，放置10min→每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释后轻微摇动原生质体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min，离心后在不含PEG的培养基中清洗→离心，在相同的培养基上重悬浮。

PEG法的缺点：有毒，融合率低：不超过1％

对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。

不对称融合：父母本在后代中贡献不同，射线处理，化学处理

IOA（不影响核的分裂而影响细胞质分裂）

★胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，就形成胞质杂种。

体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法：形态学，细胞学，分子遗传学。

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