细胞冷冻保存法及解冻培养技巧

培养细胞时为防止以下问题，细胞将做冷冻保存:第一、株化细胞产生性状转变(transformation)。第二、污染。第三、株化细胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在一定的代数范围内进行增殖培养或进行特定实验。目前可能解决这些困难的方法其中之一是细胞冷冻保存法，将冷冻细胞储于冷冻管中，将其中一部分拿出来做一些必要的检查，其它的冷冻细胞则在需要时拿出来解冻，用来进行实验。本方法亦可节省继代培养时所花费的劳力、物力，并可防止培养中经常发生意外事故，丧失细胞珠。因此冷冻保存法为细胞培养研究上之基本技术之一。

[说明] :

1.经过冷冻保存后的细胞，其生存率会下降，冷冻时之冷却速度，保存温度，解冻时升高温度的速度以及添加之冷冻保存液之种类、浓度等都可影响细胞存活率。

2. 一般而言，４℃以下慢慢地冷冻，保存于液态氮中(-196℃)。

3. 37℃快速解冻。

4.保护剂（抗冻剂）：添加甘油 (glycerol) ( I0 %左右 ) 或dimethy1sulfoxide (DMSO) ( 5- 10% ) 。

5.有些细胞如果采用上述的方法时，无法得到高的存活率。此时，则必需考虑可能伤害细胞的机制，添加剂之作用等而来找出适当的条件来修正。

[材料] :

1.增殖期之细胞 (9成满)，培养于培养皿中数个。

2.冷冻用培养基(2倍) : 培养基内加入三倍血清及15% DMSO，保存在冰箱中。

3. 冷冻管、保利龙制容器、铝制ample支持棒。

[步骤]:

1.准备2 x 107cells/ml的细胞悬浮液。

2.冷冻用培养基(2倍) :以微温水溶解DMSO，在培养基中混合为15% (v/v)。这是DMSO的二倍浓度之溶液。必须在进行实验前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必须和细胞悬浮液的量相等；使用时维持在4℃。

3.分装: 在冷冻管管中分别加0.5ml (1/2冷冻管体积)冷冻用培养基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的细胞悬浮液；等量混合。将盖子扭紧后，在管中部贴上胶带密封。

4.记载卷标 : 用抗冻marker pen在冷冻管上写明细胞名称、代数、冷冻的年，月，日等所需要的项目。

5.放进冷却的保利龙容器中，而在- 80℃的超低温槽中放置一个晚上。

6.放进液态氮容器中及保存 : 在支持棒上装上冷冻管，迅速地放进容器内。

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