大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定

 

1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。

2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。

3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。

4.比较不同培养基的生长曲线

 

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期。这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。

 

1. 菌种：

大肠杆菌（Escherichia coli）

2. 营养琼脂培养基：根据产品说明配制

3.  生理盐水（0.9%NaCl）100mL，分装入10支试管（每支9mL）

4．培养基：本实验采取正交实验确定大肠杆菌最优的生长条件，采取L₉3⁴正交表，正交设计如下：

表头（L₉3⁴）：

 

实验设计：

培养基经121℃灭菌20min。

 

721型分光光度计、比色杯、恒温摇床、培养箱、高压灭菌器、电子天平、pH计、酒精灯、电炉、接种环、试管架、培养皿10个、无菌吸管（1mL）10支、烧杯、试管、锥形瓶12个（250mL）、胶头、牛皮纸、硅胶塞等。

 

 

种子液      标记       接种       培养       测定

 

1.标记编号

  按要求配制培养基，将无菌培养基装于10个250ml锥形瓶，分别编号为0h，4h，6h，8h，11h，14h，16h，18h，19h，21h。

 

2.接种培养

(1)种子液制备：

取大肠杆菌（Escherichia coli）斜面菌种一支，用接种环刮取少量细菌于生理盐水（或无菌水）中，用胶头滴管震荡均匀。

    

(2)摇床培养：

用1mL无菌吸管分别准确吸取1mL种子液加入已编号的9个三角瓶中，于37℃下在恒温摇床上培养（180r.min^-1）（以上步骤均需在无菌操作台上操作）。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中（2-4℃）贮存，待培养结束时一同测定OD值。

 

3.生长量的测定

将未接种的培养基倒入比色杯中，选用640nm分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

 

4.对第16h的培养液进行倒平板。

 

对所得数据进行生长曲线的绘制，比较各组培养基生长曲线上最大吸光度，

 

1.刚买来的菌种一般是冻干菌，应如何接种到斜面？

2.在培养基调pH时应选用什么试剂？

3.在接种培养时，对应时间取出三角瓶后，为什么要立即放到冰箱中贮存？

4.正交试验设计中，应如何进行数据处理分析？正交试验是如何确定最佳生长条件？