病毒学实验技术（2）

鸡胚接种 

（一）鸡蛋选择和孵化  选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。鸡胚对所要接种的病毒应无免疫力，因为其抗体可由母鸡经卵黄而传给胚胎。以来航鸡蛋或其它白壳蛋为好，因为白壳蛋照蛋时较易于观察。孵化时以孵卵箱较好，培养细菌的温箱也可以用，但和孵小鸡一样，特别要求温度、翻蛋和湿度适当相对湿度为60％左右，所用温度和孵小鸡相似，但最低可用36℃，一般37.5℃，高可到38.5℃，每日翻蛋最少3次，开始可以将鸡蛋横放，要接种的前两天立放，气室向上，接种前两天特别注意鸡胚位置，希望近中央，不要过分偏在一边，胚胎偏在一边易死亡。接种前两天若发现过分偏在一边，照蛋后将偏在一边的胚胎朝下放，可以矫正到鸡胚趋向中央。

孵化三、四天，可用照蛋灯在暗室观察，鸡胚发育处的血管即明显可见。没有鸡胚发育也无血管的是未受精蛋。有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。实验室接种用的鸡胚最小是6日龄，最大是12、13日龄。此时鸡胚构造如图20-2所示。 

（二）接种前准备 

1．病毒的接种材料事先应经无菌检验，即接种到一管硫羟代乙酸肉汤（或肉汤、熟肉培养基各一管）不生长。要达到材料无菌，可采取以下措施：

（1）所取材料应无菌，处理（如研磨、离心取上液等）过程中也无细菌污染；

（2）如所取材料已污染，可在每ml材料中加青霉素和链霉素各达1000～5000单位（常用1000～2000单位），置室温中1小时或冰箱中12～24小时处理。或经滤器除菌。

2．照蛋，以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要做卵黄囊接种或血管注射，还要划出相应的部位。

3．用碘酒在接种处的蛋壳上消毒，并在该处开孔。

（三）鸡胚接种方法  鸡胚接种的方法很多，此仅列举其中较常用的一些方法。同时，当列举的接种途径有几种技术时，也仅选择其中最广泛应用的一种。图20-3

1．卵黄囊（Yolk sac）接种：大型的原生小体性病毒和立克次氏体易在卵黄囊膜内生长。虽然许多较小的病毒也可用卵黄囊途径接种，但这些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎组织内增殖，而不是侵害卵黄囊组织和在其中增殖。

（1）日龄和准备  孵化5～7天的鸡胚较为适用，因为此时的卵黄囊较大。在检蛋灯上检蛋，并用铅笔画出气室的边缘。气室部分的蛋壳称为壳帽，待碘酊干后，在天然气室的正中处用钻钻一个孔。

（2）接种和孵育  应用装有2.54cm长的8号针头的注射器，将针头全长穿过壳帽上的孔直向下插（与鸡蛋的长轴平行），并把接种物注入卵黄囊内。通常接种0.2～0.5ml。随后用石蜡——凡士林混合物封闭蛋壳孔，并将鸡蛋置37℃孵育。

（3）收获程序  收获时将蛋直立于蛋盘内。用无菌镊子打碎蛋壳，并将壳帽除去。将暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的灭菌10ml吸管吸取卵黄。如需收获卵黄囊膜，可将蛋内容物迅速倾于一个灭菌平皿内。卵黄囊常在操作时破裂。卵黄囊呈深黄色，易于识别。用无菌镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开，并与胚胎剥离，迅速移置于一个灭菌平皿内。如欲收获鸡胚胎，可用弯头牙科探针钩住胚胎的颈部取出之，并用无菌剪刀剪去附着的膜后移置于灭菌平皿内。

2．尿囊腔（Allantoic carity） 接种流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他多数病毒都易在尿囊壁的内胚层细胞内生长，并释出于尿囊液中。脑脊髓炎病毒和流行性腮腺炎病毒在用这个途径接种时也易增殖。

（1）日龄和准备  取孵化8～11天的鸡胚，检蛋，并用铅笔画出气室边缘。将蛋直立，气室向上。在鸡蛋的侧面离气室底上方几毫米、绒毛尿囊膜发育良好处选好一点。用碘酊消毒该点及其周围部分，在蛋壳上用钻钻一个孔或用针穿刺一个孔。

（2）接种和孵育  取一长1.3cm的7号针头，接在吸有接种物的小注射器上，通过蛋壳上的钻孔，与鸡蛋长轴平行地或者呈一定角度地将针插入尿囊腔内。每个蛋注射0.2～0.5ml的接种物。随后用热的石蜡—凡士林混合物封闭蛋壳上的钻孔。将蛋置37℃孵育。

（3）尿囊液的收获  为使收获时不致因出血而有血液流到尿囊液内，可在收获前将鸡胚置冰箱内冷藏4～6小时。将鸡胚直立放置并用无菌镊子除去气室上的蛋壳、暴露气室底。气室底由敷覆在绒毛尿囊膜上的内壳膜构成。用一把弯头小剪将这些膜撕去。为了便于采集尿囊液，可置入一把镊子，使其尖端朝向蛋壳，将胚胎挤向一侧。此时即可应用5或10 ml灭菌吸管吸取尿囊液。

3．绒毛尿囊膜（Chorioallantoic membrane）接种

（1）日龄和准备  取9～11日龄的鸡胚，检蛋，并用铅笔在血管最丰富处的蛋壳上画出一个lcm2的区域,应用5％石炭酸消毒蛋壳，待其干燥。不用碘酊消毒，因为酒精溶液可经蛋壳吸收，并在绒毛尿囊膜上产生病变，可能被误认为是由病毒引起的。用钻子沿蛋壳上的铅笔线钻开。必须十分小心，切勿弄破内壳膜。随后在天然气室上，象上述卵黄囊接种法那样的钻孔或刺孔。将蛋平放，使钻开一小块蛋壳的一侧向上。用尖头镊子或牙科探针轻轻地将已钻开的蛋壳取去。此时暴露出内壳膜，它的下面就是绒毛尿囊膜。滴上一滴无菌生理盐水，使内壳膜软化。取一长约0.64cm的7号针头连接于l个lml注射器上，使针头尖的斜面以45°角接触这个已软化的内壳膜部分，稍稍向下一压，即可因牵引而在内壳膜上造成一个裂缝。必须注意不要损伤下层的绒毛尿囊膜。因为内壳膜的纤维斜向行走，所以应使注射器与鸡卵长轴呈45°角，这样向下一压，就可将纤维分离而不撕断。随后用橡皮球在天然气室的钻孔上吸气。也可以在吸气前先在裂缝上滴加一滴灭菌盐水。吸入的盐水可以帮助绒毛尿囊膜与内壳膜分开。当部分鸡蛋内容物向原来的天然气室部分转移时，绒毛尿囊膜即塌落。绒毛尿囊膜与内壳膜分离和绒毛尿囊膜塌落的证据，就是内壳膜变为透明。

（2）接种和孵育  用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的裂缝插入，滴加0.1～0.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。继续孵育，使蛋壳窗向上。

另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下：在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。

（3）膜组织的收获  将蛋平放，蛋壳窗向上。用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。

因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚7、8日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。随后用石蜡—凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。此后按第一法所述方法进行孵育和收获。

4．羊膜（Amniotie）接种  此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。

（1）日龄和准备  用7～15日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。

（2）接种和孵育  接种时应用lm1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。刺破羊膜囊时的一个证据，就是胚胎发生一个突然运动。随后稍将针头回抽，并注入0.1～0.2ml接种物。蛋壳上的钻孔用石蜡—凡士林混合物封闭，将蛋直立，继续孵育。

（3）羊水的采集  象尿囊腔和卵黄囊收获方法那样除去蛋壳。在气室底上滴加几滴生理盐水，使膜透明。以胚胎的眼睛作为参考依据，用连接一个短的6号针头的注射器吸取羊水。

5．其他

（1）静脉内  这一鸡胚接种方法实际上不常用。操作时应用12～14日龄的鸡胚。以检蛋法标记出一根大静脉。如前述方法除去该静脉上方的一小块四方形蛋壳。滴加1小滴灭菌矿物油于内壳膜上，使其变为透明。将一连接在小注射器上的4号针头顺血流方向插入于静脉内。随后注入0.1～0.5ml的接种物。如前述，孵育并收获。

（2）脑内  这是培养狂犬病毒时偶而使用的方法。

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