包埋法固定化微生物问题初探(1)

摘  要  本文概括介绍并比较了固定化技术的几种主要的方法，并对目前笔者正在进行的包埋法固定化试验中的两个方法——海藻酸钠包埋法和PVA—H₃BO₃包埋法做了一定的介绍和不同方法的比较。最后，简要介绍了固定化细胞的性能的评价以及该种技术的应用和前景。

关键字 固定化 包埋法 海藻酸钠  PVA—H₃BO₃  载体

1、引言

固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点。固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。

2、常用的固定化方法

废水处理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交联法、载体结合法。

 2.1包埋法

包埋法的原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。

固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：

（1）    固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化；

（2）    成本低；

（3）    固定化过程中及固定化后对微生物无害；

（4）    基质通透性好；

（5）    固定化细胞密度大；

（6）    载体内细胞漏出少，外面的细胞难以进入；

（7）    物理强度和化学稳定性好；

（8）    抗微生物分解；

（9）    沉降分离性好。

 在这些要求中，（1）和（2）涉及固定化细胞制备的成本；（3）~（6）针对固定化细胞的催化活性；而（7）~（9）则是出于对固定化细胞的操作稳定性的考虑。

2.2交联法

交联法是使用双功能的试剂与酶分子进行分子间的交联固定化方法。由于酶蛋白的功能团参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶显著失活。此外，交联剂如戊二醛等价格昂贵，限制了其应用。

2.3吸附法

又称载体结合法，是通过物理吸附、化学或者离子的结合，将微生物固定于非水溶性载体。这种方法操作简单，对微生物活力影响小，但所结合的微生物数量有限，反应稳定性和反复使用性差。主要分为物理吸附法、共价结合法、离子结合法和生物特异性吸附法四种方法。

2.4三种固定化方法的比较

尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法。交联法突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛的应用。吸附法的固定操作简单，条件温和，而且载体可以再生；但是细胞与载体之间的结合力较弱，因此操作的稳定性不好。包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程（包括反应器的设计、操作稳定性等）中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，使细胞的催化活性受到限制，且不适用于涉及大分子物质的反应。三种固定化方法总结于下表：

 

表一 三种固定化方法的比较

 

3、包埋法固定化微生物的两种方法举例

天然高分子多糖类的海藻酸钠，具有固定化成形方便，对微生物毒性小以及固定化密度高等优点，但是其抗微生物分解性能较差，机械强度较低，同时海藻酸钠凝胶再高浓度的磷酸缓冲液的反复冲击下，经过一段时间，颗粒变软、粘连。合成高分子化合物中常用的载体材料是聚乙烯醇（polyvinyl alcohol 简称PVA），其突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学稳定性能好。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。下面将对这两种包埋方法作一个简单的介绍：

3.1海藻酸钙包埋法

3.1.1原理

    海藻酸钙包埋法是一种使用最广、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点。

海藻酸是用于包埋固定化微生物的第一个聚合物，但是当存在高浓度的K⁺、Mg²⁺、磷酸盐以及其他单价金属离子时，海藻酸钙凝交的结构会受到破坏。此外，由于海藻酸钙凝胶网络的孔隙尺寸太大，酶可能会从网络中泄露出来，因此不适合大多数酶的固定化。

海藻酸盐是棕色藻类的胞内产物，它由两种不同类型的单糖组成，即1，4—β—D—甘露糖醛酸（M）和1，4—α—L—古洛糖醛酸（G）。海藻酸盐是一种聚合物。

海藻酸盐不能形成热可逆性凝胶。通常是在其钠盐溶液中加入二价离子，如Ca²⁺，通过Ca²⁺取代Na⁺来形成凝胶网络。凝胶的性质与引入的二价阳离子及海藻酸钠的类型（主要是两种单糖的组成比例）有关。

二价阳离子对凝胶的机械强度有较大的影响，元素周期表的第二主族金属离子于海藻酸钠盐形成的凝胶，其强度顺序如下：

Ba²⁺>Sr²⁺>Ca²⁺>>Mg²⁺

利用海藻酸钠凝胶固定化微生物法安全、快速、制备简单，反应条件温和，成本低廉且适用于大多数微生物的固定化。

3.1.2固定化方法

以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法如下：

方法I

①将海藻酸钠加热溶于水；

②将海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%~4%；

③将海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%~10%的CaCl₂溶液中，固定化7~8h；

④滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

方法 II

①将按方法I制得的固定化细胞颗粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中搅拌1~2h；

②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；

③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

方法III

①将按方法I制备的固定化颗粒浸泡于下列溶液中：

  壳聚糖 0.5%   CaCl₂ 0.2mol/L  pH 6.0

②滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；

③滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。

 分别利用以上三种固定化方法，包埋黑曲酶细胞，比较各种固定化细胞的活性，其结果如表二：

 

                      表二 海藻酸钙包埋法的比较

固定化方法	方法I	方法II	方法III
固定化细胞相对活性	57.1%	52.9%	44.8%

 

由表二可以看出，用海藻酸钠系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化细胞的活性较高。其中用方法I固定化细胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸钙凝胶表层突上了一层高分子膜，虽然增强了固定化颗粒的机械强度，但是同时加大了底物及氧的扩散阻力，从而降低了细胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛对细胞液具有毒性，在使用前应作毒性试验，确定是否采用改种交联剂。

3.1.3海藻酸钠包埋法固定化试剂对细胞活性的影响

（1）海藻酸钠对细胞活性的影响

    海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物没有毒害作用。但海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、质量传递等，进而影响到微生物的活性。

海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响如表三所示。

 

表三 海藻酸钠浓度对细胞活性的影响