沙门氏菌回复突变实验

 

目的：学习利用细菌检测基因突变的方法 

Ames试验  即鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验，是目前检测基因突变最常用方法之一。 

原理：利用鼠伤寒沙门氏菌突变株，即组氨酸缺陷型，其原始菌株菌体内的组氨酸是通过自身一系列酶催化反应合成的，这种能自身合成所需营养成份的菌株叫做野生型菌株。本试验用鼠伤寒沙门氏菌为突变株，其不能合成组氨酸，而必须由外界提供这种菌珠被称为营养缺陷式营养实变型（his-）。当诱变剂作用于菌株后，在菌株遗传物质的特定位点发生基因回复突变成为野生型（his+），故在缺乏组氨酸的培养基上，只存少数自发回变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而可判断被药物是否具有致实变性。 

材料：菌株，鼠伤寒沙门氏菌TA97，TA98，TA100，TA102。 

器材：恒温培养箱，干燥箱，高压消毒锅，水溶锅，紫外线灯（15w），药物天平，分析天平 酒精灯，滤纸片，平皿，试管，烧杯，吸管。 

培养基配制 

1．Vogel-Bonner液10×（VB液10倍浓缩）用于配制底层基本培养基。配制方法：硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）1g，柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）10g，磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）65.5g，磷酸氢铵钠（NaNH₄HPO₄·4H₂O）17.5g。将上述成分依次用蒸馏水溶解、混匀，然后加蒸馏水至500ml，置4℃冰箱保存。 

2．底层基本培养基  取VB液（10倍）100ml，加入蒸馏水800ml，用1mol/L NaOH调pH至7.0，然后加入琼脂12—15g，经121℃20分钟高压灭菌。待冷至800C左右时，加入100ml已经112℃20分钟高压灭菌的20%葡萄糖液，混匀后浇制平板。 

3．上层培养基  D-生物素12.4mg，L-盐酸组氨酸9.5mg，NaCl5g，琼脂6g，上述成分依次加热溶解，混合，然后加蒸馏水至1000ml。分装后经121℃15分钟高压灭菌备用。 

方法 

1．药物的剂量选择 

对于易溶解的药物，实验最高剂量可采用抑菌浓度下的最大剂量，或以最大溶解度为最高剂量和5mg/皿为最高剂量，下设5个剂量，（即5000，500，50，5，0.5，0.1μg/皿）。溶剂：药物是水溶性，可用灭菌蒸馏水，如非水溶性可选二甲亚砜为溶剂。 

2．平板掺入法 

每皿加底层培养20～25ml，待凝固。取融化并保温于45℃的上层培养基，分装于5ml试管中，每支试管2ml，依次加入新鲜菌液0.1ml， 药物0.1ml，需加S9时则加入S9混合液0.3ml，混匀，迅速倒在底层培养基上，使之分布均匀。待上层琼脂凝固后，翻转平板置37℃培养48小时后，观察结果。

观察结果时，首先应观察各实验组和阴性对照的背景菌苔的生长情况。在肯定背景菌苔与阴性对照相差不多后，再比较各剂量组的回变菌落数。若回变菌落数的出现有剂量反应关系，回变菌落数大于自发对照的2倍或以上，结果并具有重现性，并有统计学意义的增加，可判断为阳性，反之为阴性。

 

附录：Ames 试验记录表，实验者可视需要对表加快修改对所用菌株进行鉴定 

1．组氨酸营养缺陷（his^-）鉴定。取两块底层葡萄糖琼脂平板，其中一块加入0.1mol/L L 一组氨酸0.1mol和0.5mmol/L生物素0.1ml，另一块（对照）只加入生物素。用白金耳先在生物素对照平板上划线，然后再在组氨酸/生物素平板上划线，四种菌株可划在同一平板上。在培养皿底部用标记笔注明每一菌株划痕。翻转平板，37℃培养24~48小时，观察细菌生长情况。对照平板无细菌生长，含组氨酸平板应有细菌生长。 

2．深粗糙突变（rfa）鉴定—结晶紫抑菌试验  加0.1ml等测菌液于装有2ml上层培养基（融化后保持在45℃）的试管中，旋摇混匀后倾倒于营养琼脂平板上，倾斜旋转平板使之分布均匀。凝固后，将一灭菌滤纸片放在平板上，于纸片中心滴加1mg/ml结晶紫10μl，或先用灭菌滤纸片沾取结晶紫液，再放置平板上。倒置平板，在37℃培养12~24小时如在纸片周围出现明显的抑菌带（约10mm），则表明有rfa突变存在。 

3．uvrB鉴定——紫外线敏感试验  用灭菌拭子拈取测试菌株在营琼脂平板上做平行划线。有R因子的菌株（TA₉₇，TA₉₈，TA₁₀₀等）划线在另外的平板上。用黑纸遮住无盖平板的一半，另一半在距离33cm处，用一个15W紫外线灯照射，有R因子菌株照射8秒钟。在同一平板上，应用时用切除修复功能的菌株（如TA₁₀₂）作为对照。平板照射后，在37℃培养1~24小时，具有uvrB缺陷的菌株，只在未经照射的一侧平板上生长。 

4．R因子（pKM101质粒）鉴定—抗氨苄青霉素试验  用10μl左右氨苄青霉素（8mg/ml，0.02mol/L NaOH）在营养琼脂平板上划线，同时用等测菌液在同一平板上与氨苄青霉素交叉划线。在同一平板上可鉴定几种菌株，其中包括一种没有R因子的对照菌株（如野生型），用以说明氨苄青霉素的效力。在37℃培养12~24小时，无R因子者在两线交叉处出现抑菌，有R因子者则无抑菌现象。亦可仿照鉴定rfa突变的方法，用浸有氨苄青霉素的滤纸片贴在已接种R因子待测菌株的平板上。若纸片周围无抑菌圈，则表明对氨苄青霉素有抗性，即R因子存在。 

5．pAQ1质粒鉴定——抗四环素试验  方法类似R因子鉴定，四环素浓度为8mg/ml，0.02mol/L HCl，用量10μl。 

6．自发回变鉴定  加0.1ml待测菌液于含有2ml上层培养基的试管中，混匀后铺倒在底层基本培养基上。37℃培养24小时，计数每皿自发的回变菌落数。 四种标准菌株的回变菌落数（不加S9）

 

营养肉汤配制（增药用），氯化钠0.5g、牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、双蒸水100ml，溶解后，用4N NaOH调pH至7.2 ，15磅灭菌20分钟，备用。