真菌的DNA和RNA提取方法（2）

二、真菌DNA的提取（方法二）

1.真菌菌丝0.5-1g，在液氮中迅速研磨成粉

2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min，期间混匀2-3次

3.加入1mL 5M KAc，冰浴20min

4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）

5.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，静置约30 min

6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中

7.加入1ul RNaseA（10mg/mL），37℃处理1h

8.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）

9.取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上

10.沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用

DNA提取缓冲液：100mM Tris-HCl（pH8.0），20mM EDTA（pH8.0），1.5M NaCl，2% CTAB(W/V)，4% PVP40（W/V）和2%巯基乙醇（V/V），PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc

方法一和二，是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样！

 

三、真菌菌丝的总RNA的提取

1.实验试剂

（1）RNA提取缓冲液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100mM Tris-HCl（pH8.0,DEPC处理的水配置），25mM EDTA，0.5g/L 亚精胺Spermidine，2.0M NaCl，2%巯基乙醇（V/V，使用前加入）。由于在高温灭菌条件下，Tris-HCl要和DEPC发生反应，所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理的水配制即可

（2）SSTE：1 M NaCl，0.5% SDS（W/V），10mM Tris-HCl pH8.0，1.0mM EDTA

（3）10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl，加1‰的DEPC过夜后，高温灭菌

（4）3M NaAc

（5）氯仿:异戊醇（24:1）

（6）酚（pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）

（7）DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜，高温灭菌

（8）无水乙醇；70%酒精

 

2.实验步骤

（1）实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热，离心管中加入ME（巯基乙醇），（10mL加80ul，50mL中加入300ul）

（2）取约0.8g菌丝体（液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了），在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液，颠倒混匀

（3）65℃水浴3-10 min，期间混匀2-3次

（4）加入等体积的酚（注意是酸酚pH4.5）:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5 min）

（5）取上清，等体积的氯仿:异戊醇（24:1）抽提（10,000rpm，4℃，5 min）

（6）加入1/4V体积10M LiCl溶液，4℃放置6h以上（或过夜）

（7）10,000rpm，4℃离心20min

（8）弃上清，用500ul SSTE溶解沉淀

（9）酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）抽提两次，氯仿:异戊醇（24:1）抽提1次（10,000rpm，4℃，5min）

（10）加2V体积的无水乙醇，在-70℃冰箱沉淀30min以上

（11）12,000rpm，4℃离心20 min

（12）弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次，干燥

（13）加200ul的DEPC处理水溶解

（14）用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

（在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数）

注意：提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。