真菌的DNA和RNA提取方法（1）

录入时间:2011-7-18 14:11:59 来源：百度

一、真菌DNA的提取（方法一）

1.实验试剂

（1）DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS

（2）3M NaAc

（3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA

（4）酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)

（5）氯仿:异戊醇(24:1)

（6）异丙醇

（7）无水乙醇

（8）75%乙醇

（9）RNaseA

2.实验步骤

（1）取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

（2）加入4mL提取液，快速振荡混匀

（3）加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本）

（4）1000rpm，4℃，5min

（5）上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000rpm，4℃离心5min）

（6）取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min

（7）用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ul TE中

（8）加入1ul RNaseA （10mg/mL），37℃处理1h

（9）用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）

（10）取上清，1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，-70℃沉淀30min以上

（11）沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ul TE中，-20℃保存备用