结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的特性和检测方法

 

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

 

结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

 

1.  液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。 2.  固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米黄色、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。 

3.  结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

 

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法（操作） 

【原理】

结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。

 

【材料】

1.   结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。 

2.  抗酸染色液 

3.   载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。

 

【方法】

      1.  无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。 

　　2.  用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。 

　　3.  用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。 

　　4.  滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。

 

【结果】

      1.   结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。 

　　2.  涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。 

　　3.  结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。 

　　4.  标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证操作者的安全。

 

此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

 

【材料】

      1.   动物：体重200~250克豚鼠2只

　　2.   结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）

　　3.   注射器及消毒用材料等。

 

【方法】

      1.   选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。

　　2.   吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下0.1ml

　　3.   注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。

　　4.   给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。

　　5.   6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

 

【材料】

结核病人24小时痰液，细口瓶，0.02%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。

 

【方法】

(一)漂浮法：

      1.   取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量0.5%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。

　　2.   待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。

　　3.   取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

 

(二)沉淀法：

      1.   取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入0.02%酚红指示剂0.1毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。

　　2.   矫正PH为7.0，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。

　　3.   取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

 

附录：抗酸染液的配制

      1.   石炭酸复红液：称取硷性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。

　　2.   3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。

　　3.   吕弗勒氏硷性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液0.1毫升即成。