微生物细胞的显微直接计数法

 

了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，用显微镜直接测定微生物总细胞数。

 

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和稀释平板计数法。

 

直接计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，则难于直接测定。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同、只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌难于区分。

 

血球汁数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽所构成的3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度应有两种：一种是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开)，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开)，而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

 

计数区边长为1mm，则计数区的面积为1mm²，每个小方格的面积为1/400mm²。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以计数区的体积为0.1mm³，每个小方格的体积为1／4000mm³。

 

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每mL菌液(或每g样品)中微生物细胞的数量。

已知：1mL体积＝10mm×10mm×10mm＝1000mm³

 

所以：1mL体积应含有小方格数为1000mm³／(1／4000mm³)＝4x10⁶个小方格。即系数K＝4x10⁶。因此：每mL菌悬液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数(N) x系数(K) x菌液稀释倍数(d)。

 

(1)活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )斜面菌种或培养液。

 

(2)器材：显微镜、血球计数板、盖玻片(22mm x 22mm)、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。

 

 

(1)视待测菌悬液浓度，加无菌水适量稀释(斜面一般稀释到10^-2)，以每小格的菌数可数为度。

 

(2)取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

 

(3)将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴(不宜过多)，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，注意不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片(勿使产生气泡)。

 

(4)静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下观察到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应适当关小孔径光阑并减弱光照的强度。

 

(5)计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格(即100小格)的菌数。如果是25个大方格组成的计数区．除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数(即80个小格)。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

 

(6)对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，求出每一个小格中细胞平均数(N)，按公式计算出每mL(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。

 

(7)测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。