微生物的保存技术（2）

 

2   病毒的超低温保存法 

 

2.1   一般概念 

 

         大多数微生物可用超低温保存，超低温保存法是适用范围最广的微生物保存法。 需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真 菌） ，通常可用超低温的方法保存（ATCC  1983；Halliday，Baker  1985） 。

        此法是将冻存 在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管 贮存在—150～－196℃的液氮中。 超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。ATCC 常用一种由甘油（10％） 、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入 37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。在长期贮存 的过程中必须经常注意补充液氮。这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。 

 

2.2    材料 

 

病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（Nunc Cryoflex） ，液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。 

 

2.3   方法 

 

（1）剪一段两端各超出冷冻管长度 2cm 的热收缩塑料管。 

（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将 0.2ml 冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。 

（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。 

（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。 

（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。 

（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套） 。 

（7）将冷冻过的冷冻管放入液氮罐中的格子内，同时记录样品的详细的存放位置、实验编号和存放日期等。 

（8）需要用时，迅速从液氮罐内取出所需样品，并投入 37℃水浴箱中解冻后，用解剖刀片在冷冻管的硅化垫圈处切开热收缩塑料管。拧开冷冻管的盖子时不需要除去热收缩塑料管。 

 

3    低温保存法 

 

3.1   材料 

 

（1）培养基： 

2 号营养肉汤粉（Unipath）             2.5g 

甘油（Sigma）                                  15ml 

蒸馏水                                                  85ml 

将上述材料混匀后，分装在 5ml 瓶内，在 121℃下灭菌 15 分钟。 

（2）厌氧菌用 BGP 培养基〔其中不加琼脂，而加 15％（体积比）甘油〕 ： 

胰蛋白胨（Unipath）             1.0g 

氯化钠                                       0.5g 

牛肉提取物                               0.3g 

酵母提取物                               0.5g 

盐酸半胱氨酸                           0.04g 

葡萄糖                                       0.1g 

磷酸氢二钠                                0.4g   

甘油                                          15ml 

蒸馏水                                       85ml 

将上述材料混匀后，分装在 10ml 瓶内，在 121℃下消毒 15 分钟。以上两种培养基使用前均能在 4℃环境中存放几个月。 

（3）玻璃珠：将直径为 2mm 的玻璃珠（Creative  Beadcraft  Ltd；mersham，Buckinghamshire，UK）按上述冻干法中的清洗法清洗。 

（4）冷冻管：在 2ml有盖冷冻管（Nunc，Paisley，Scotland）内存放 20～30 粒清洗好的玻璃珠，盖好盖后置 121℃下消毒 15 分钟。消毒过的冷冻管可在室温下保存。 

        此外，将超低温冰箱预先冷却到—70℃，灭菌塑料加样头。 

 

3.2   方法 

 

（1）用非选择性固体培养基（如营养琼脂或血琼脂）在适宜细菌生长的条件下培养细菌。 

（2）无菌条件下加 2ml 细菌悬浮液至营养肉汤中。 

（3）用一支无菌的塑料环将细菌和肉汤混匀（细菌的最终浓度为 108～1010 个细胞／ml） 。 

（4）按冻干法在无菌条件下将细菌分装到有灭菌玻璃珠的冷冻管内，反复吹打几次，使珠子内部的气泡完全被细菌悬浮液所替代。 

（5）吸去冷冻管内多余的液体。 

（6）将混有细菌和珠子的冷冻管放在架子（Jencons Scientific Ltd，Leighton，Buzzard，Bedfordshire，UK）上，然后将架子放入—70℃的冰柜内。 

（7）从冰柜中取出一支冷冻管，在无菌条件下打开，用灭菌镊子从管中取出一粒珠子，然后迅速将管子放回冰柜，以免管子内的其余珠子融解。 

（8）直接将珠子接种到固体培养基上或液体培养基中，在适当的条件下培养。