微生物纤维素酶分子生物学研究进展

摘要:概述了近二十年来纤维素酶分子生物学的研究情况 ,包括纤维素酶合成调控、纤维素酶基因结构、基因复制及纤维素酶合成调控。

 

关键词:纤维素酶;分子生物学;进展

 

        纤维素是世界上最丰富的再生能源 ,约占生物总量的 50 % ,但由于其组成结构的复杂性 ,转化利用纤维素一直是个问题。现在人们渴望通过纤维素酶的研究开发来解决 ,对其 分子生物学的研究是一重要方面。

 

1 　纤维素酶合成的调控 T1 Reesei 纤维素酶的合成受纤维素的诱导而受易利用的 糖阻遏。因为纤维素的不溶性 ,不能进入细胞 ,并不是纤维素 酶的直接诱导物。早在 1962 年 ,科学家就发现槐二糖是 T1Reesei 较强的诱导物。人们设想槐二糖是通过将纤维二糖β-葡萄苷酶的转糖作用形成的 ,可能是 BGL Ⅱ的作用。然而 还没有最终证明它是否是纤维素酶的直接诱导物。亦未证明 纤维二糖和其它的纤维素水解的氧化产物或木二糖也是否是直接诱导物。

        另外 ,纤维二糖作为诱导物比较复杂 ,在高水平时 ,它抑制了纤维素酶的生成。通过缺失突变检测单一的纤维素酶组分在产生其它组分的诱导物中的作用时发现 cbh2或egl2缺失使得其它纤维素酶基因不能表达 ,bgl1基因缺失突变使得内切葡萄糖苷酶活性降低和 cbh1、 cbh2、 egl1 和 egl3 转录延迟。表明 CBHⅡ和 EGⅡ在诱导物的生成中起重要作用 而BGL Ⅰ则有部分作用。 T1 Reesei 纤维素酶的合成为转录水平调控。菌株 QM9414cbh1 ,cbh2 ,egl1 ,egl2 和 egl5 的表达是通过转录因子调节的。编码转录因子ACEⅠ和ACEⅡ的基因连接在 cbh1启动子的部位。ACEⅡ和Aspergillus niger 转录激活物 XINR 同源,ACEⅡ也刺激了纤维素酶和木聚糖酶基因表达。 分解代谢物阻遏蛋白 CREⅠ阻碍了 T1 Reesei 纤维素酶基因的转录。T1 Reesei Rut C - 30是高产纤维素酶菌株 ,有 cre Ⅰ基因突变。有葡萄糖时 ,仍产生纤维素酶 ,没有葡萄糖时 ,酶会有低水平的合成。

        因此细胞中可能存在分解阻遏和能量状 态之间的联系。对四种丝状真菌研究表明 ,在胞内 ATP浓度 在 10 - 7mgΠ ml 以上时 ,胞外纤维素酶产生受阻 ,且 cAMP在酶合成的阻遏中有重要作用。纤维素酶合成的低水平可能允许 诱导物的继续生成 ,通过有限的纤维素的水解 ,从而调节纤维素酶产生的进一步诱导。槐二糖或其它诱导物通过转录激活 因子ACEⅠ和ACEⅡ的作用机理还不清楚。 T1fusca纤维素酶基因表达在两个水平调控:纤维二糖诱导和葡萄糖存在时的分解代谢物阻遏。没有纤维素或纤维二糖时 ,CelR阻遏纤维素酶的产生。

        然而纤维二糖作为诱导物 激活 CelR ,从而使其从启动子上解离 ,使得纤维素酶基因转录。有葡萄糖时 ,分解代谢物阻遏可能通过 cAMP水平调 节。在有纤维二糖时 ,许多菌株的纤维素酶产量很高而在有 木聚糖、明胶、淀粉时 ,产量较低 。这说明在葡萄糖中时 ,纤维素酶为组成型表达 ,纤维素酶产物受分解代谢物阻遏。 C1 hermocellum 在碳源受限时形成纤维素酶小体。在C1thermocellum 指数期末和静止期初期发现了 celA和celD ,然 而celF 只出现在静止期初期。        

        因此 ,纤维素酶的合成可能是分解代谢物阻遏的负调节 ,然而纤维素酶小体会受到所用碳 源的影响。如用纤维素作为碳源比用纤维二糖所产生的外切 葡萄糖苷酶多。C1thermocellum 纤维素酶小体在纤维素中时产 生 ,但如在可溶性碳如葡萄糖、果糖、纤维二糖甚至 CMC中时不产生。然而 , C1cellulovorans 在纤维二糖和 CMC中有高酶活力。这说明在可溶碳纤维素酶可能产生但纤维素酶体的装配和从细胞壁解吸需要一些不溶微晶纤维素的存在。Do2erner , et al 报道在 celA和 celC被纤维素诱导时基因进行组成 型表达 ,然而 ,Wang , et al 报道纤维糊精酶 celA 和 celE都为纤 维素诱导。

 

2 　纤维素酶基因的结构 在细菌和真菌中 ,编码纤维素酶的基因都位于染色体上 

        真菌纤维素酶基因通常随机地分布于整个基因组中 ,每个基 因有其自己的转录调节单位。T1 Reesei cbh1 ,cbh2 ,egl1 ,egl2的 启动子比较发现 CRE1结合位置的存在(1) 。ACEⅠ和 ACEⅡ通过结合于 cbh1启动子部位而激活转录。细菌纤维素酶基因在基因组中或随机分布或形成基因 簇。C1cellulovorans 基因簇大约22kb ,包含9个纤维素酶基因 ,3’侧翼区有推定的转座酶基因 ,在 C1cellulolyticum 和 C1 ace2tubutylicum 中亦发现相似的结构。在这些基因簇中 ,有转录终止子 ,然而启动子基因还未发现。

 

3 　基因复制和水平基因转移解纤生物中 ,相关生物或同一生境远缘生物之间有大量 同源纤维素酶基因。这表明存在染色体重排或水平基因转 移。类似 P1chrysosporium CBH1 基因簇说明基因复制现象。但如纤维素酶和半纤维素酶 ,可能表明同一祖先基因经历较 大的底物特异性趋异变异。超嗜热微生物巨酶催化区的不同 结构排列和多 CBM很可能起源于基因穿梭。 水平基因转移在纤维素酶基因进化中作用只是最近才有证据 , C1cellulovorans 基因簇可能通过转座方式形成。厌氧真菌的葡萄糖水解酶基因无内含子 ,怀疑从细菌中得。Vallve ,et al的分析研究表明 ,厌氧真菌有可能从细菌中获得纤维素酶基因 ,瘤胃的高微生物浓度为水平基因转移提供条件。现已证明瘤胃中的水平基因转移现象。这表明了生境中基因组的可塑性。使厌氧真菌可以得到新的基因。

 

4 　纤维素酶分子结构 分解纤维素的真菌和细菌 ,其纤维素酶基本是多结构域的 ,只有个别是单结构域。一般的结构域都有催化区 ,它通过一柔性的多链接区连于 CBD上。此结构主要在非复合的纤 维素酶系中。复合酶系的酶更加多样。纤维素酶小体至少包括一个催化区连于 CBD上。然而有的酶包含多个 CBD ,一个纤连蛋白 Ⅲ型区和一个类似 IG区域。最复杂的酶是那些极端嗜热细菌。厌氧超嗜热 Caldicellulosiruptor TOK7B11 巨酶通常有两个催化区 ,一个纤维素酶区 ,一个半纤维素酶区 ,通过几个 CBD连接。 真菌和细菌纤维素酶结构有一定区别。真菌连接桥一般富含 Gly、 Ser和 Thr ,而细菌则完全由 Pro - Thr 这样的重复顺 序组成 ,真菌 CBD由 33 - 36 个氨基酸组成 ,且具有高度的同源 ,而细菌由100 - 110 个氨基酸组成 ,同源性较低。另外 ,在分子形状上 ,真菌 CD、连接桥和 CBD呈直线连接 ,而细菌连接 桥、 CD、 CBD之间呈135°。 T1 reesei CBHⅠ的 CBD是一个β折叠片形成的楔形结构 ,一面疏水 ,一面亲水。疏水面与底物表面接触 ,而后者是两个 β折叠片面对面形成β三明治( sandwich) 。但它们吸附面相似都较平坦暴露几个芳香氨基酸及一些潜在氢键形成的残基。 

 

        如上所述 ,纤维素酶的分子生物学方面还有许多不清楚的地方。相信随着研究者的不断努力会使其逐渐发展完善。