病毒实验诊断及质量控制

 

　　病毒感染病原学诊断在疾病的预防上可了解流行病学情况，疫苗的免疫效果以及采取及时的免疫措施及必要的隔离和防护，在病毒感染的诊断和治疗上可避免不必要的诊断检查，避免滥用抗生素。对某些病毒疾病可选用有效的抗病毒药物，如用阿糖腺苷或无环鸟苷治疗单母子疱疹脑炎，丙氧鸟苷治疗严重的巨细胞病毒感染，病毒唑雾化吸入治疗呼吸道合胞病毒肺炎，齐多夫定、AZT治疗爱滋病等。对一些病毒感染可进行预后判断，如没有得到及时抗病毒治疗的单纯疱疹脑炎病人预后极差，肝炎病人长HbeAg阳性者预后不良。

 

 一、常用实验方法

1．病毒分离常用方法：用活细胞、组织、胚胎或动物分离病毒。细胞培养分离病毒主要过程：细胞培养，病毒分离和病毒鉴定。基本原理：病毒在活的敏感细胞、组织、胚胎或动物体内复制繁殖。意义：从病变部位（活检组织、脑脊液、疱疹液、体腔积液）或血液中分离到病毒的诊断意义很大。从粪便中分离到病毒（如巨细胞病毒，肠道病毒等）的意义应结合其它病毒学检查结果（如抗病毒抗体等）来判定。

 

2．电子显微镜直接检查病毒常用方法：普通电子显微镜检查，免疫电子显微镜检查。基本原理：标本经负染处理后，根据病毒颗粒的形态作出判断。意义：能根据病毒颗粒的形态诊断，如轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒、星状病毒等。

 

3．检测病毒的抗原成分常用方法：对组织或细胞内的病毒成分可用免疫荧光染色、免疫酶染色等；对细胞外的或可溶性的病毒成分可用方法有：凝集试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫、免疫渗滤层析试验（胶体金）等。基本原理：抗病毒抗体致敏的血球或吸附抗病毒抗体的载体颗粒与病毒结合；病毒抗原和抗体在凝胶中相遇形成沉淀线； 标记的抗病毒抗体与相应的病毒抗原结合或反应，通过某种指示系统显示病毒抗原的存在。意义：对大多数病毒而言，病毒抗原阳性一般可作为诊断急性病毒感染的依据。但对有些病毒（如巨细胞病毒，受滋病毒，乙肝病毒），病毒抗原阳性常不能说明宿主的感染状态，如急性、慢性或携带状态。该方法能用于早期快速诊断病毒感染，特别适用于临床。

 

4．病毒血清学常用方法：中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验、免疫荧光、免疫酶染色、ELISA、化学发光、时间分辨免疫荧光、荧光偏振、胶体金。基本原理：抗原和抗体特异性地结合或反应，通过某种指示系统显示病毒抗体的存在。意义：恢复期血清中抗病毒抗体滴度≥4倍升高有诊断意义； 血清抗病毒IgM抗体阳性可作为诊断该病毒近期感染的依据。

 

5．基因诊断（检测病毒遗传物质，如PCR）常用方法：PCR、套式或巢式PCR、逆转录PCR 基本原理：在体外条件下（至少1对DNA引物，dNTP，缓冲液）DNA聚合酶催化合成与模板DNA互补的新链。意义：病毒核酸阳性一般可作为诊断病毒感染的依据，但对有些病毒（如巨细胞病毒，爱滋病毒，乙肝病毒），不能说明宿主感染状态，如急性、慢性或携带。由于PCR的敏感性非高常，实验条件要求严格，根据PCR试验结果有时尚不能确定病毒或现疾病的关系，该技术在检测不同标本，诊断不同病毒性疾病中的意义有待进一步评价。

 

二、常用实验方法的评价

1．病毒分离优点：是诊断病毒性疾病的金标准，特异性强，能发现新病毒，反应传染性，可在试验动物中验证。缺点：耗时长，一般只能做回顾性诊断，成本和技术要求高，敏戌性不高，有些病毒无法或极难培养，不同的病毒需要不同的分离方法。发展方向：短时细胞培养加免疫荧光或免疫酶染色法快速检测病毒抗原。

 

2．免疫荧光或免疫酶染色法优点：能检测细胞内的抗原，需要相对较少的细胞，固定后的标本可存放相当长的时间，能显示病毒抗原的组织学和细胞学分布特点。免疫酶染色法不需要荧光显微镜。工作人员需有丰富的经验，试验结果可能受主观因素的影响。免疫酶染色有可能受内源性酶的影响出现假阳性。间接法的敏感性比直接法的敏感性高，但特异性稍低。

 

3．ELISA 优点：可用机器判读结果，便于自动化和一次性检测大量标本，检测病毒抗体的敏感性比免疫荧光法或免疫酶法高。缺点：检测抗原时，与免疫荧光法相比，敏感性较低，一般只能检测可溶性病毒抗原。发展方向：重组抗原，捕获法。

 

4．化学发光法优点：正常用免疫学方法中最敏感，判断结果较客观，可自动化，一次可检测大量标本。缺点：多为进口产品，试剂和仪器较贵。

 

5．电子显微镜优点：可直接检测标本；能发现新病毒；能直观地显示组织或细胞内的病毒。可用于检测极难分离的病毒。缺点：机器价格昂贵，技术要求高，不太适用于常规病毒学诊断试验或大量标本的检测；病毒量较大时才易得到阳性结果，应用范围有限，且不能鉴别病毒的血清型。

 

 6．基因诊断，如PCR 优点：敏感、特异，是目前使用的病毒学诊断技术中最敏感的技术方法；一次可检测 较大量标本；能检测出与宿主细胞基因组整合的病毒核酸序列；可用于检测目前不能或不易分离的病毒。缺点：对诊断未知病毒的感染无能为力，被检测的病毒核酸序列必须已经清楚；需要较多仪器设备，试验成本较高；有试验污染的可能性。发展方向：杂交PCR，定量PCR

 

三、质量控制　

　买病毒诊断试剂盒时，应检查是否经过评价。每次做试验时都必须设对照，包括阳性对照和阴性对照。不宜漫无目标地做过多的病毒学试验，避免由于假阳性结果或与现疾病无直接关系的试验结果干扰或延误诊治病人。某些病毒有血清学反应的交叉（如副流感病毒与肋腺炎病毒，艾可病毒与林萨厅病毒，乙型脑炎与登革热病毒等）。用单克隆抗体检测病毒抗原能提高试验特异性，但有假阴性的可能。理论上说，用混合单克隆抗体检测病毒抗原，诊断病毒感染较好。用病毒学试验来排除病毒感染的可能性并不总是可靠的。用不同技术方法测得的抗病毒抗体滴度差异很大。临床医师应认直分析病毒学试验的结果，并采取合理的诊疗措施。  　　

 

采集标本一般要求做到早：特别是对病毒分离、抗原或核酸检测。快：尽快检测新鲜标本，不能及时检测的标本短时间可低温保存，用于组织或细胞内病毒抗原检测的标本应固定后再冷藏保存。冻存的标本忌反复冻融。近：用于病毒分离、抗原或核酸检测的标本应尽量取自病变部位或接近病变部位（如脑炎取脑脊液，腹泻取粪便，呼吸道感染取鼻咽分泌物或支气管灌洗液）。多：标本的量不能太少，如有可能一次取多种标本，在病程急性期和恢复期都取标本。净：避免污染标本，特别是用于病毒分离或PCR检测的标本。

 

目前，国内已开展病毒实验诊断室间质量评价，但内容与国外相比要少得多，有条件的实验室应积极参加国内组织的室间质评计划，促进病毒实验诊断检验质量的提高。美国CAP开展的病毒实验诊断室间质评内容 

 

作者：寿好长 金京南

作者单位：北京中医药大学东方医院