临床病原体检查的常用方法（1）

 

感染（infection）是病原体（pathogen）和人体在一定条件下相互作用的病理过程，感染的病原体包括各种细菌、病毒、寄生虫、真菌、支原体、衣原体、螺旋体等。病原体的来源可分为外源性和内源性感染两种类型。外源性感染是由于外界的病原体侵入人体，如志贺菌、结核分枝杆菌、人免疫缺陷病毒（HIV）等引起的感染。内源性感染是人体内经常寄生的微生物，如大肠埃希菌、肠球菌、某些真菌等在一定条件下引起的感染。

 

感染后是否引起感染性疾病（infection diseases）与病原体的数量、毒力和人体的抵抗力有关，并决定感染的发生、发展和结局。病原体感染后机体可以出现不感染、隐性感染（covert infection）、显性感染（overt infection）、持续性感染（persistent infection）或病原体携带状态（carrier state）几种类型。感染性疾病是由于感染的病原体毒力强、数量多，超过了机体的抵御能力，定植在机体一定部位增殖、扩散或蔓延、释放毒素，引起机体免疫病理反应，导致组织、器官等损伤，生理功能紊乱，并出现一系列的临床症状和体征。

 

感染性疾病的检查主要包括病原体的检查、感染的血清学试验等，并由此确定感染性疾病的发生和性质；通过病原体的药物敏感试验、耐药株监测和医院感染的监测报告，为临床感染性疾病的最佳治疗药物选择，采取最有效的预防措施，防止感染的传播或流行提供及时、有效的实验数据。

 

下面介绍临床病原体检查的一些常用方法：

 

㈠细菌感染的检查

 

    1、涂片检查

 

     临床标本或分离培养物涂片直接或染色后光学显微镜观察，可为进一步做生化反应、血清学鉴定等提供参考依据。通过显微镜观察有无病原体及其大致数量，病原体形态、染色特征等，可以迅速作出初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和脑脊液中的脑膜炎奈瑟菌等。

 

     ⑴不染色标本的检查     不染色标本一般用于观察细菌动力及运动情况，因为不染色标本直接在普通光学显微镜下，不能清楚看到细菌的形态与结构特征。细菌未染色时呈无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境不同进行观察。有鞭毛的细菌在镜下呈活泼有方向的运动，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法。例如，在高倍暗视野显微镜下悬滴米泔样粪便，观察到来回穿梭似流星样运动的细菌；另制备一标本加入O1群霍乱弧菌诊断血清，若来回穿梭似流星样运动的细菌停止运动，为制动试验阳性，可报告疑为O1群霍乱弧菌。

 

     ⑵染色标本的检查

 

     细菌标本经染色后，与周围环境在颜色上形成鲜明的对比，可在普通光学显微镜下清楚看到细菌的形态和某些结构。常用的细菌染色法有：①单染色法只用一种染料将细菌和周围物体染成同一种颜色，称为单染色法。如吕氏美蓝或稀释石炭酸复红染色法。细菌经单染色法处理后，可观察其形态与排列、大小及简单的结构，但不能显示细菌染色特性。②复染色法用两种或两种以上的不同染料进行染色，可将不同细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。本法既可观察细菌的形态结构，还可根据染色反应及着色深浅鉴别细菌的种类，故又称鉴别染色法。常用的有革兰染色法（Gram stain）和抗酸染色法(acid-fast stain)。 通过革兰染色，可将细菌分为革兰阳性（G+）和革兰阴性（G-）两大类，有助于缩小范围、初步鉴定细菌。例如，在脑脊液涂片中发现G-的肾形、凹面相对的双球菌，且在吞噬细胞内或外，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阴性双球菌，形似脑膜炎奈瑟菌”；若发现有革兰阳性双球菌，呈矛尖状、宽端相对尖端向外，且菌体周围有荚膜，则可报告“脑脊液直接涂片找到革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。

 

 

2、分离培养与鉴定     采集临床标本在选择性或非选择性培养基分离培养，观察细菌的菌落形态、生化反应、毒素产生等，并用已知特异性抗体的免疫血清鉴定临床标本中或分离培养物中未知的细菌，确定致病菌的属、种和血清型（血清学鉴定）等。

 

     ⑴分离培养：①增菌培养：由于标本中的细菌较少，用人工的方法提供生长繁殖所需的营养和最适条件，如温度、湿度和气体环境，使其迅速生长繁殖，使菌量增多，供进一步作纯培养或分离致病菌。大部分细菌在24~48h内培养生长良好。②分离培养：对于混有多种细菌的临床标本或其他培养物，经过划线接种到合适的选择性或非选择性固体培养基表面，因划线的分散作用，使许多原先混杂的细菌在固体培养基表面分离，一般经过18~24h培养后形成由一个细菌繁殖而来的细菌集团—菌落（colony），供细菌计数和纯培养用。挑选单个菌落，转种至另一培养基中，生长出来的细菌均为纯种，称为纯培养（pure culture）。分离纯培养是从临床标本中检查鉴定细菌非常重要的第一步，只有先从含有多种杂菌的标本中分离出目的菌纯培养，才能进一步对目的菌予以鉴定和研究。

  

  ⑵鉴定：根据纯培养细菌的染色形态、培养生长特性、生化反应和血清学试验结果，对分离培养的细菌作出鉴定。目前，大多数临床细菌实验室多借助自动化细菌鉴定与药敏试验系统，可简便、快速、准确地鉴定各种分离培养的细菌，并同时完成抗菌药物的敏感性试验。

 

     3、分子生物学诊断     PCR技术直接扩增病原体基因的保守序列，配合DNA探针杂交、DNA序列分析、基因芯片（gene chip）技术等，检测临床标本中或分离培养物中细菌的核酸，可以对感染的细菌作出明确的诊断、分类、基因分型和直接检测耐药基因等，菌落原位杂交也常用于快速筛选阳性克隆。特别是分子生物学检测技术操作的自动化分析仪，如自动化DNA提取仪，定量PCR仪，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪等，使得病原体的分子生物学诊断有可能在临床常规应用

 

     ⑴细菌的快速鉴定：几乎所有致病菌的基因都可直接从标本中进行扩增后检测而不受非致病菌的影响，尤其是对分离培养比较困难的细菌（如结核分枝杆菌）更具特殊意义。目前已用于结核分枝杆菌、沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希菌等致病菌的快速鉴定。鉴定各种需氧菌和厌氧菌至种的水平，如鉴别金黄色葡萄球菌、中间葡萄球菌及家畜葡萄球菌，鉴别铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌及荧光假单胞菌，鉴别艰难梭菌、双酶梭菌及索氏梭菌。

 

     ⑵细菌的分类鉴定：通过对两菌株DNA杂交百分率判断其同源性，若＞70%为高度同源性，基因组差别很小；如果两菌株DNA杂交百分率＜25%为非同源性，两者不相关。 

 

     ⑶细菌毒素的检测：细菌的特异性毒素基因序列决定所产生毒素的种类，可用PCR扩增特异的毒素基因片段或直接用其特异性毒素基因探针检测致病菌的毒素基因，如霍乱肠毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素、艰难梭菌毒素等。     ⑷细菌耐药性检测：通过扩增细菌的耐药基因或直接用耐药基因的探针检测标本中或纯培养细菌有无耐药基因，可以及早了解细菌对某些抗菌药物的耐药性或进行耐药性研究，如耐甲氧苯青霉素葡萄球菌的mecA基因、耐β-内酰胺抗生素的TEM型β-内酰胺酶基因。

 

 

     ⑸流行病学调查：通过分析流行菌株基因的同源性，可作为流行病学或医院感染流行菌株调查的依据。