单核细胞增生李斯特菌及其检验

单核细胞增生李斯特菌及其检验
 Listeria monocytogenes

一、概述

单核细胞增生李斯特菌 (L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。

    李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。据报道，健康人粪便中该菌的携带率为0.6％～16％，4％～8％的水产品、5％～10％的奶及其制品、30％以上的肉制品及15％以上的家禽均被该菌污染。李斯特菌能在1～45℃的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏室内较长时间生长、繁殖。

    人感染的主要来源是食用被该菌污染的食品，主要通过粪-口途径传播。自然感染的传播途径包括消化道、呼吸道、眼结膜以及皮肤损伤。本菌主要引起致死性的脑膜炎和脓毒症，孕妇流产和新生儿细菌性脑炎。此菌的致病力强，尤其是免疫缺陷病人感染后，病死率可高达30%～70%。近几年来，李斯特菌病已呈世界性分布，北美和西欧等许多国家人食源性李斯特菌病日渐增多，且引起多起病人的死亡。因此，食品中存在的单核细胞增生性李斯特氏菌对人类的安全具有危险，如今已有20多个国家把它列为“食品致病菌”。

二、生物学特性

(一)形态与染色特性

该菌为革兰氏阳性短杆菌，有的菌体略弯曲，两端钝圆，大小约为0.4～0.5µm ´ 0.5～2.0µm。多单在，有时是V字型排列。  无芽孢，不产生荚膜。在陈旧培养物中或粗糙型菌落的菌体长度可达6～20µm或更长的丝状。在20～25℃培养时可产生2～4根鞭毛而运动，但在37℃培养时鞭毛发育不良，无运动性。

(二)培养特性

本菌需氧或兼性厌氧，生长温度为1～45℃，最适温度为30～37℃。对营养要求不高，可在普通琼脂培养基中生长，但在血琼脂培养基或胰酪胴琼脂上生长更好。加入0.2％～1％(W/V)的葡萄糖及2％～3％(V/V)的甘油生长更佳。在含1%(W/V)NaCl的复合培养基中能生长。在4℃可缓慢增殖，形成菌落约需7d。

在液体培养基中培养18～24h后，肉汤呈轻度均匀混浊，数天后形成粘稠沉淀附着于管底，摇动时沉淀呈螺旋状，继续培养可形成颗粒状沉淀。不形成菌环、菌膜。

在营养琼脂上，光滑(S)型可形成直径0.5～1.5mm、圆形、露滴状半透明、低隆起、边缘整齐、表面有细致纹理的蓝灰色菌落，斜射光照射时，菌落呈特征性蓝绿光泽。R型菌落表面起伏不平，边缘不整齐，细菌难以乳化。

在血液琼脂培养基上，可形成狭窄的β-溶血环，常不超出菌落边缘，移去菌落才可见。弱溶血或疑似溶血菌株可用协同溶血试验(CAMP)鉴定。

半固体培养基：沿穿刺线呈云雾状，随后缓慢扩散，在培养基表面下3～5mm处呈伞状。

(三)生化特性

该菌接触酶阳性，氧化酶阴性。能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、鼠李糖、麦芽糖、山梨糖，不发酵木糖、阿拉伯糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、蜜二糖、菊糖、纤维二糖和侧金盏花醇。不利用枸橼酸盐。不还原硝酸盐，不产生靛基质和硫化氢。甲基红及VP试验呈阳性。不液化明胶和凝固血清。可水解七叶苷和马尿酸钠。

(四)抵抗力

该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活。对碱和盐的抵抗力强。常规的巴氏消毒法不能杀灭它，60～70℃经30 min才能杀死此菌。该菌体外试验对青毒素、氨苄青霉素、四环素均敏感，对土霉素敏感性差，对磺胺、枯草杆菌素和多粘菌素有抵抗力。

Listeria monocytogenes is a Gram-positive rod-shaped bacterium. It is the agent of listeriosis, a serious infection caused by eating food contaminated with the bacteria.

The disease affects primarily pregnant women, newborns, and adults with weakened immune systems.

Listeriosis is a serious disease for humans; the overt form of the disease has a mortality greater than 25 percent. The two main clinical manifestations are sepsis and meningitis. Meningitis is often complicated by encephalitis, a pathology that is unusual for bacterial infections.

This normal inhabitant of the gastrointestinal tract and of animal feces led to a 1986 outbreak in Massachusetts hospital patients.

Oxoid Limited has launched a new chromogenic medium for the improved isolation, enumeration and identification of Listeria from food samples.  In addition to providing presumptive identification of Listeria species, Oxoid Chromogenic Listeria Agar ( OCLA ) Plate (PO5165A) is also able to differentiate pathogenic Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii from other Listeria species.

 

三、检验

常规细菌学检验   检验规程见GB/T 4789.30－2003

1. 涂片镜检    用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。

2. 增菌培养    EB增菌液30±1℃培养48h～7d。LB1增菌液培养24h，取出0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。

3. 分离培养    将EB增菌液和LB2二次增菌液划线于选择培养基琼脂平板上，30±1℃48h，挑选可疑菌落，用白炽灯斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色、小的圆形菌落。

选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和EIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，及成伞状或月芽状生长。一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA-YE)上，做纯培养供做以下鉴定。

4. 细菌鉴定

(1)对小鼠的致病力试验：取0.5mL浓缩菌液注射小白鼠腹腔，接种3～5只，观察小鼠死亡情况。致病株2～5d 内死亡。单核细胞增生李斯特氏菌对小鼠有致病性，在肝和脾可见到局部坏死，并能从脏器和心血中分离出细菌。

(2)协同溶血试验(CAMP)：在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌(R.equi)，在它们中间垂直接种可疑李斯特氏菌，但不要触及，30℃培养24～48h，检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，而绵羊李斯特氏菌在马红球菌附近的溶血增强，有助于鉴别。

5. 结果报告    根据病料涂片镜检结果可作出初步判断；依据细菌分离培养和细菌鉴定的各项试验结果，可作出从检样中检出单核细胞增生李斯特菌的报告。