MPN法测定硝化细菌数量

硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化成亚硝酸和硝酸的过程。它是由两类细菌分两个阶段完成的。第一阶段是氨氧化为亚硝酸，由亚硝化菌完成；第二阶段是由亚硝酸氧化为硝酸，由硝化菌完成。所以测定时需要测定亚硝酸菌和硝酸菌数量

 

实验样品来自实验一不同高度取出的滤料，测砂子上硝化细菌：取1g砂子在无菌水中振荡多长时间？

改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基A、B

 

(NH₄)₂SO₄        2.0g             

NaH₂PO₄         0.25g

MnSO₄·4H₂O      0.01g

MgSO₄·7H₂O      0.03g

K₂HPO₄          0.75g

CaCO₃           5.0g

蒸馏水           1000ml

PH               7.2

 

NaH₂PO₄         0.25g

K₂HPO₄          0.75g

MgSO₄·4H₂O      0.03g

MnSO₄           0.01g

CaCO₃            1.0g

Na₂CO₃           1.0g

NaNO₃                 1.0g

蒸馏水            1000ml

PH                7.2

 

 

121℃灭菌         30min

 

无菌吸管、试管（1.8cm×18cm）、白瓷比色板、接种环、酒精灯等。

 

格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液：

第一液：将0.5g的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）加到150ml的20%稀醋酸溶液中。

第二液：将1gα-萘胺（α-naphthylamine）加到20ml蒸馏水和150ml的20%稀醋酸溶液中。

 

二苯胺试剂：溶0.5g无色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸馏水及100ml浓硫酸（相对密度1.84）中即成。

 

1.2实验方法：

1.2.1亚硝酸菌测定：将培养基A分装于试管中，每管5ml，每个样品需培养基19支试管。砂粒悬液采取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7六个稀释度。在每个培养基中，用无菌吸管接种砂粒悬液1ml。每个稀释度重复3管，另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。于25～28℃培养。10～14d后，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。从《三次重复数量指标》表中求的数量指标后，换算成每克干砂粒的亚硝化细菌数量。

 

1.2.2硝酸菌测定：将培养基B分装于试管中，每管5ml，每个样品需培养基16支试管。砂粒悬液采取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、五个稀释度。在每个培养基中，用无菌吸管接种砂粒悬液1ml。每个稀释度重复3管，另取一管培养基接种1ml无菌水作为对照。于25～28℃培养。10～14d后测定硝酸的产生，取出培养液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺试剂2滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。从《三次重复数量指标》表中求的数量指标后，换算成每克干砂粒的亚硝化细菌数量。

 

1.2.3《三次重复数量指标》（略）