病毒基础知识（3）

（四）分子病毒学的研究时期
　　自从1953年DNA双螺旋结构理论建立以来，由于分子生物学的迅速发展，新技术和新方法的应用，使得病毒学的研究步入了分子病毒学的发展时期。50年代至60年代是分子生物学的奠基时代，而病毒特别是噬菌体和植物病毒为此做出了巨大的贡献,因此分子病毒学也正是分子生物学的发展过程中应运而生。分子病毒学的发展是各相关学科如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学与病毒学理论和技术相互渗透的结果。尤其是分子生物学新技术的发明极大剌激了分子病毒学的发展。分子病毒学的发展经历了如下过程：
　　1953年，Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构理论，它使人们开始从分子水平上去认识遗传物质--DNA的结构基础和复制特性，理解基因表达与性状的关系，从而为分子生物学和分子病毒学的创立奠定了基础。
　　1962年，D.L.D.Casfar阐明了许多病毒的二十面体结构，明确了病毒核衣壳二十面体的构成规律，这是对病毒超微结构认识的重大突破。
　　1962年，D.Nathans成功地进行了噬菌体RNA的体外翻译；1965年，S.Spiegelman成功地在体外复制出Qβ噬菌体RNA；1967年M.Goulian成功地体外复制ΦX174噬菌体。这些工作对以后阐明DNA病毒和RNA病毒 的繁殖机制起了重要作用。
　　1967年，T.O.Diener发现了类病毒，他在试图分离马铃薯纺锤形块茎病的病毒时，发现其病原不是病毒，而是一种不含有蛋白质，分子量为105左右的裸露RNA。这样小的RNA分子不编码任何蛋白质。根据其特殊的性质，Diener把这类致病因子称为“类病毒（Viroids）”。随后的研究表明，类病毒RNA还有特殊的复制机制。类病毒的发现在分子病毒学史上是一个重要事件，它不仅揭示了自然界存在着比病毒更简单的生物，而且也使人们加深了对生命起源的认识。在类病毒报道之后，有人在澳大利亚又发现了类似于类病毒的环状RNA分子还能与病毒基因组RNA共同包被于RNA病毒粒子中，引起绒毛菸、苜菪和地三叶草产生病害，其中类似于类病毒的RNA称为“拟病毒（virusoid）”。羊瘙痒病(scrapie)最初也认为是类病毒引起的，Prusiner于1982年证实瘙痒因子不是类病毒，而是一种分子量只有3.0×104的蛋白质，称为“蛋白侵染因子”或“朊病毒”（prion）。根据类病毒的发现，Lavoff（1981）首先提出把病毒分为真病毒（envirus）和类病毒的概念。随着拟病毒和朊病毒的相继发现，1983年在意大利召开的“植物和动物的亚病毒病原：类病毒和朊病毒”国际学术讨论会上，把类病毒、拟病毒和朊病毒列入亚病毒（subvirus）。
　　1968年，P.H.Duesberg发现流感病毒的多节段RNA基因组，随后在其他一些病毒中如呼肠孤病毒、大麦条纹花叶病毒中也发现了病毒基因组分节现象的存在。
　　1970年，P.H.Duelerg发现Rous肉瘤病毒含有癌基因v-src，而且在正常鸡以及其他脊椎动物和无脊椎动物的DNA中，也发现有癌基因v-src的同源序列存在，推测病毒癌基因是来自于细胞正常基因。随着其他肿瘤病毒致癌基因的发现，肿瘤病毒的细胞培养系统建立，以及肿瘤病毒对细胞转化诱导作用的确定，使人们对肿瘤发生的机制有了更深刻的了解。
1970年，H.M.Temin和D.Baltimor分别发现了病毒的逆转录酶。逆转录酶基因组RNA在逆转录酶的作用下，首先合成原病毒DNA，然后原病毒可整合到宿主染色体DNA上。除了病毒癌基因外，原病毒在宿主DNA上的插入、整合，也可以引起细胞癌基因的激活和细胞转化，逆转录酶和逆转录过程的发现，是对Crick 1958年提出的遗传学中心法则的重要补充和发展，说明遗传信息不仅可以从DNA RNA，也可由RNA DNA。
　　1971年，限制性内切酶技术的发现为DNA序列分析和病毒基因的定位创造了条件，利用这一技术曾经成功地为乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒构建了酶切图谱。另一些新技术如基因转移方法、Southen blot的相继诞生，也加快了病毒特异性基因，尤其是转化基因的定位和病毒核酸序列分析的进程。除此以外，70年代出现的DNA重组技术，使一些病毒基因组能在原核细胞的质粒载体上克隆，并在细菌中能够得到大量复制和表达产物，因而有利于探寻病毒的基因组结构和功能。
　　1977年，英国剑桥大学的Sanger完成了ΦX174-DNA全部序列的测定,为此Sanger第二次获得诺贝尔奖。根据ΦX174-DNA全部序列的分析结果，Sanger意想不到地发现了基因重叠现象。随后，在DNA噬菌体如R17、MS2、F2、Qβ中也证实了基因重叠现象的存在，这是病毒利用有限的遗传信息执行更多的功能，提高自身在进化过程中适应能力的一种表现。
　　1977年，L．T．Chow阐明了腺病毒转录过程中的mRNA拼接现象，随后在SV40、多瘤病毒中也相继发现了mRNA转录后的拼接过程，从而证实了真核基因的不连续性，明确了内含子（intron）和外显子（exon）的概念。
　　1978年，W．Fiers和V.B.Reddy测定了SV40-DNA的一级结构由5224个碱基对组成。SV40是第一个全部核苷酸序列被搞清楚的真核病毒，它含有结构基因VP1、VP2、VP3以及转化基因T和t，整个基因组有12.5%非编码区或非翻译区，在这些区域中包含启动子、增强子序列和其他调节序列，可对病毒基因组复制、转录、翻译进行调控。由于SV40既是研究真核基因结构和表达的良好模型，又是研究癌变机制的理想材料，因此，SV40-DNA一级结构的测定具有重要意义。
　　在70年代，Miller和Barbara研究ΦX174-DNA转录时还发现了ΦX174-DNA仅有一条链被转录，他们利用ΦX174噬菌体感染大肠杆菌，并在培养基中加入32P-磷酸盐以制备放射性的噬菌体mRNA，然后再将标记的mRNA分离出来，让其与分开来的RF-DNA正负链杂交，结果观察到仅有RF-DNA的负链与标记mRNA形成杂交体。因而让实在活体内ΦX174的RF DNA中仅一条链是转录的模板。与此相类似，T7噬菌体DNA在活体中也只有一条单链被转录。但在T4或λ噬菌体中情形较为复杂,其基因组中的某些部分是以一条链作为模板，而在另一区域，则是以另一条链为模板。大肠杆菌基因组的转录也同样存在一组基因与另一组基因的模板链不同。

1979年，T．Taniguchi用载体成功地表达了人干扰素基因。这是基因工程的一项大突破。进入八十年代后，分子病毒学的研究无论是在深度和广度都有了很大的发展。这里只举一些重要进展。
　　1981年，D.K.Kleid等利用重组DNA技术制备出口蹄疫病毒疫苗；
　　1982年，J.Summers等发现乙型肝炎病毒DNA复制中有逆转录过程；
　　1982年，B.Moss和E.Paoletti用痘苗病毒作为载体表达外源基因；

1983年，Montagnier和R.C.Gallo分别分离到与AIDS相关的人类逆转录病毒（HIV）；
　　1985年，H.Vonder Patten等在3A下阐明了鼻病毒的晶体结构;
　　1988年，Chuo和Yamaya用弱病毒全长cDNA导入产生抗病毒的转化植株；
　　1990年以来，PCR技术在分子病毒学领域得到了广泛应用，目前PCR已成为病毒性疾病诊断和研究的重要手段。

1993年，美国科学家K.Mullis由于发明了PCR仪而与第一个设计基因定点突变的Smith共享诺贝尔化学奖。
　　1991年，Han等将Moloney鼠白血病毒的反义表达序列导入小鼠受精卵中，从而培育成功对该病毒有抗性的转基因小鼠。
　　1992年，Desrosiers等利用SIV mac239/nef缺失突变株制备出减毒活疫苗，取得了抗SIV感染成功，也给HIV疫苗的研究赋予了许多启示。
　　1995年，HIV天冬氨酰蛋白酶三维结构的鉴定，使得一些针对病毒蛋白酶活性位点的抑制剂先后问世。

1996年，David Ho利用逆转录酶抑制剂与蛋白酶抑制剂配成的“鸡尾酒”式药，成功地抵抗了HIV感染，因而1996年称为AIDS希望年。
　　1997年，美国加利福尼亚大学的神经病学和病毒学教授S.Prusiner由于发现了羊瘙痒病的致病因子是朊病毒（prion），以及提出了疯牛病、Creutz-feldt-Jakob氏病、Kuru病等脑退化性疾病是由朊病毒引起的理论，而获得了诺贝尔医学奖。然而朊病毒究竟是一种传染性因子，还是由正常基因突变形成的结构异常的蛋白质，至今仍处于争论之中。
　　病毒学经过上述四个时期的发展，逐渐形成和成熟起来，随着病毒基因组复制、基因表达调控原理、病毒与宿主细胞的相互作用规律，病毒感染和致病的分子机制的揭示，以及分子病毒学在技术上的革新和进步，它将为人类克服和战胜病毒病做出贡献。