细胞培养培养基

基础培养基

 

绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂(例如核苷酸)。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。

 

在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培养基中这两种物质缺乏时)。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。

 

原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。

 

血清

 

细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清用于神经元培养，也有人用马血清来培养胶质细胞。用大鼠进行神经元培养的某些研究者喜欢使用同型血清;人类的胎盘血清，亦曾用于神经组织的器官类型的培养，也用在一些特殊培养种类中。

 

血清的不同批号含有不同的成分，所以许多人发现，应该在使用前对血清进行测试。大多数试剂商提供样品，所满意的批号即可选用，这样可以一次得到足够一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。

 

无血清培养基

 

1979年神经细胞培养出现了一个重要进展，用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清。其工作基础是用合适的激素、营养物和促贴壁的物质的组合置换培养基中的成分，最后找到了适合大多数细胞培养的试剂配方，该配方称为N2，专门用于神经细胞培养，最早是用在B104大鼠神经母细胞瘤细胞系的培养。它的基础培养基是1：1的DMEM与H12的混合液，添加了胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、腐胺和硒。胰岛素和胰岛素样生长因子对于大多数类型细胞的存活和生长有重要作用，硒是谷胱甘肽产生的合作因子，可能有助于过氧化物和超氧化物的水解，有报道说还能防止细胞的光照损伤。随后的其他配方如N1N3则含有较低浓度的转铁蛋白。

 

未料到的是上述配方构成的培养基可以支持神经母细胞瘤细胞系快速增殖，随后又发展了能支持原代培养的各种神经元生长的培养基，这种培养基在许多实验室里已取代了有血清培养。在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，这样的培养基可以消除来自血清的不均一性。更为重要的是，它们可用来检测生长因子以及其他促进神经元存活或生长的因子，或者用来检测那些可保护神经元免遭环境毒物损伤的制剂。专用于神经元的培养基在某些培养环境中还可以减低非神经元细胞的增殖，故可使神经元纯化。

 

血清中含有的组分，例如血清蛋白，可作为代谢毒物清除剂使用并能聚集于培养基中。当缺乏这些成分时，如神经元在无血清培养基中生长时，特别容易为过氧化物及自由基伤害，这已被许多研究者注意到了。过氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培养基中过氧化物和超氧化物的累积，有报道讲可以促进低密度培养细胞的存活。有学者发现细胞存活可为氧分压的下降而促进。因而，无血清培养基的配方常含有抗氧化剂的试剂。例如，维生素E和丙酮酸，可作为过氧化物清除剂使用。上述这些影响在高密度培养时变小，特别是神经元与胶质共培养时，它们可以吸收和代谢神经元毒性物质如谷氨酸。

 

应该注意，尽管无血清培养基是有化学限定性的，但在培养过程中它仍有变动，培养起始时可能有些物质缺乏，而后细胞的产物可能积累，从而使培养基的成分改变。这其实是有另一方面的好处，即条件培养基(已培养过细胞的培养基)的形成，条件培养基常常用来增加神经元和胶质细胞的发育。

 

生长因子绝大多数哺乳类胚胎神经元有严格的营养要求，若不能提供适宜的生长因子或合适的因子组分，将会使绝大多数神经元在体外培养的数天中死亡。解决这一问题有两条思路，一是让培养细胞提供自己的营养因子，二是在培养基中加入纯的生长因子。如果细胞混合物能在高密度时生长，所需的生长因子便会积累到可观的数值，尤其当培养基很少变化时。若某种细胞混合物生长时有很少的营养需求，可保持培养基在一段时间里不作任何变动，以使营养(生长)因子积累，而最后促使所需要的细胞类型能够生长。但是，这种对营养(生长)因子自身倚赖性亦有弊端，因为通常在混合细胞群体中细胞很难有同比例增殖，某些细胞会因生长条件的贫乏而受限制。另外，这种方法只能进行相当高密度的细胞培养。因为培养基的条件在细胞的较低密度时变的不够有效。不过某些时候纯化神经元群体的低密度培养可用条件培养基(经过了高密度培养)进行，或在胶质上生长的神经元所用过的培养基来支持。

 

满足神经元营养需求的第二条途径是向培养基中加入生长因子。通常用于组培的通用适宜因子是神经生长因子NGF。不过，只有少数对这种蛋白质有反应的细胞类型的细胞才能生长。

 

许多PNS类型的神经元在离体状态时表现出简单的营养需求，只需提供单一的营养因子就足以使其在低密度时增殖。例如，大鼠交感神经元仅需NGF即能存活，在其生存期间，这些神经元可在严格局限条件下生长好几个月(即在无血清培养基中、或缺乏胶质细胞、或在化学限定基质上)。有证据表明NGF是活体中交感神经元存活的生理调节因子。然而，交感神经元也对来自胶质细胞的神经营养因子(GDNF)有反应，还有NT3、LIF与CNTF也对其有作用。在不产生GDNF或NT3的动物中，交感神经元会有损伤。在离体与活体营养需求之间的差别或许可以用在不同环境中NGF含量和分布的不同来解释，培养中的NGF弥散在整个环境中，而在活体内，大部分区域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合适的浓度。尽管在大多数实验中已经习惯了营养因子的最大效应使用量，其他营养因子的协同效应在亚优剂量下更容易观察到。此外，高浓度的营养因子可使细胞更能抵抗毒剂以及其他压力。相应的，低浓度的营养因子可能用来检查表现型，例如对自由基或氨基酸的毒性刺激剂量的反应。有许多其他的PNS培养系统只需单一营养因子就可使有实用价值的细胞保持在一定比例，广为人知的有雏鸡睫状自主神经节神经元和大鼠背根神经节感觉神经元。不过，这些模型也有局限性。例如，培养中的睫状神经节的神经元加入CNTF时，超过90%的神经元能存活一个很长时期，但并未有迹象表明它属于内源的靶细胞来源的营养因子，而是有争论的相关分子，GPA，扮演了这一角色。大鼠背根神经节含有好几种细胞群体，其中小细胞群、包括nocioceptive cell，对NGF有反应，但其他神经元，例如大细胞群中的proprioception 却对不同的神经营养因子有反应。因此，在大多条件下培养物的生长并不能忠实反映亲代群体的所有特性，这一问题在CNS的细胞培养中特别突出，因为已有的经验表明，没有一种培养基能适合于所有类型及亚类的神经细胞的生长。

 

现有的证据已表明，CNS神经元的营养需求比PNS的更复杂。对脊髓运动神经元与视网膜节细胞神经元的研究表明，这些神经元与外周神经元相比能对更为广泛的营养因子起反应。例如，至少发现了15种不同的分子可在离体条件下增加神经元的存活。而且，已观察到运动神经元与视网膜对任何单独的营养因子的存活反应，与PNS中所观察到的典型反应相比，都要小得多。因此，大多数影响运动神经元及视网膜节细胞的营养因子仅仅只能支持神经元的亚群，而神经元的最佳存活要求诸多因子的结合。在视网膜节细胞的培养中，因子的最佳组合(如BDNF、CNTF、IGF、bFGF)包括了来自不同生长因子家族的代表。这一结果的普遍性尚待进一步的证实，但敲除单一的营养因子基因之后，没有表现出对CNS大多类群的神经元的存活产生太大影响，这一观察与上述的事实是一致的。现已知少突胶质细胞的长期存活也需要众多营养因子的相互作用。

 

抗生素

 

在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素(常用浓度是25~100ui/ml)与链霉素(25~100μg/ml)。这两种抗生素常混合使用。在一些实验室里，它们常规加入所有的培养基中。庆大霉素(10~100μg/ml)通常有广谱抗菌效应，并具有溶液稳定性，故也被一些实验室使用，特别是当有低水平的污染存在时更是这样。以上这些试剂对霉菌与酵母菌的污染均无效。

 

尽管很多实验室在细胞系的培养基中常规加入抗生素作继代培养，但仍建议不要在原代培养中加入抗生素，其理由之一是获得的细胞是无菌的，原代培养时的细菌污染很少发生。其次，尽管认为抗生素对细胞代谢的影响可忽略，但最好避免使用它们，以免细胞生长环境的不稳定。最重要的是要意识到培养中主要污染物的类型，它们通常暗示了问题的来源。

 

抗有丝分裂剂

 

某些DNA合成抑制剂对分裂细胞有毒，但对没有DNA合成的细胞仅有轻微影响。由于神经元通常缺乏DNA合成能力，因此对抗有丝分裂剂没有多大反应。这样的试剂常常用于神经元的培养，以消除或减少非神经元群体。若要杀死所有的非神经元细胞，可以先加入血清或生长因子来保证有高比例的非神经元细胞进行DNA合成，此时再加入抗有丝分裂剂。但是，某些细胞在它的细胞周期的某些时相时对抗有丝分裂剂是不敏感的。不过，可以重复的将抗有丝分裂剂使用于增殖的细胞群体。在CNS神经元的培养中抗有丝分裂剂常常在星形细胞形成单层后加入，此时，星形细胞由于接触抑制而终止了DNA的合成(即细胞停止增殖)，它们不会因抗有丝分裂剂的加入而死亡。原代培养中用这种方法阻止成纤维细胞的过度增殖是十分必要的。有两种抗有丝分裂剂常用于神经元的培养：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制剂，一般使用浓度为～10μM。尿苷(10μM)也常使用，可阻止不分裂细胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用浓度为5～50μM。使用任何一种抗有丝分裂剂，都必须考虑它的神经原毒性，应该确定最低效应的使用浓度。阿糖胞苷在很低的浓度下，也会对某些种类的神经元有毒性，可以造成特定神经原的死亡。其他的抗有丝分裂剂尚未表现出这种毒性。

 

培养的保持

 

培养物是应该保持在孵箱中的。孵箱可以自动将O2与CO2混合很快达到培养基的设计要求，空气中的氧浓度比血液和脑脊液中要高得多。对于某些细胞的生长，包括神经原，应使氧含量处在一个较低的水平。可以用孵箱达到这个标准，但这样的孵箱并未广泛使用。

 

高湿度可避免培养皿中培养基的蒸发，保持孵箱中的湿度通常是在箱底部放上一大盆水，这水应该经常换，乘水容器应经常消毒以防霉菌生长。若孵箱曾被霉菌孢子严重污染过，那么要想完全去除污染则会非常困难。当培养物必须要长期保持在孵箱中时，应采用较少培养基的瓶、皿，且将盖子盖紧以避免蒸发，或采用相应的按比例供空气的孵箱。

 

温度的精确调节应定期检查，孵箱温度常设置为37℃或较低温度。细胞在低温时可有较长时间的忍耐限度，但当温度升至39℃时，几小时内即死亡。

 

维持培养物的最佳方案常常改变。例如培养胶质细胞时，要经常换液以使其增殖达到最大。而在培养某些神经原时，则要求尽可能少的换液，神经原在两次换液之间的条件下长的最好。大脑皮质的培养要求在不换液的情形下维持一个月以上。另一方面，象海马神经原那样的细胞，倚赖于条件培养基，若换液太频繁细胞就会衰退，此时，可采用1/3或1/2换液的方式。