实验——微生物菌种常规保藏方法

菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

1 目的

1.1 了解菌种保藏的基本原理

1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理

菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料

3.1菌株 

待保藏的适龄菌株斜面

3.2培养基  

肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂

10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具

用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程

斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏 

5 步骤

5.1斜面保藏

5.1.1流程

标记试管→接种→培养→保藏

5.1.2步骤

5.1.2.1贴标签

取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种

将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏

斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏

5.2.1流程

标记试管→穿刺接种→培养→保藏

5.2.2 步骤  

5.2.2.1贴标签

取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种

用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 

5.2.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.2.4保藏

半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蜡油封存

5.3.1流程

标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏

5.3.2 步骤

5.3.1标记

同5.1.2.1

5.3.2接种

同5.1.2.2

5.3.3培养

同5.1.2.3

5.3.4加石蜡油

无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.3.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。这种方法保藏期一般为一至二年。

5.4砂土管保藏

5.4.1 流程

制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏

5.4.2 步骤

5.4.2.1制作沙土管

选取过40目筛的黄砂，酸洗，再水洗至中性，烘干备用；过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份砂的比例均匀混合后，装入小试管，装量1厘米左右。

5.4.2.2灭菌

加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。

5.4.2.3制备菌液

取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。震荡制成菌悬液。

5.4.2.4加样

用1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升至砂土管，再用接种环拌匀。

5.4.2.5干燥

把装好菌液的砂土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。

5.4.2.6保藏

干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。