实验——肉毒梭菌及肉毒毒素的检验

1 目的

1.1 了解肉毒梭菌的生长特性和产毒条件。 

1.2 掌握肉毒梭菌及其毒素检验原理和方法。 

2 原理

肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品为主，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。检验食品，特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒毒素或肉毒梭菌（例如罐头等密封性保存的食品），至为重要。

肉毒梭菌为专性厌氧的革兰氏阳性杆菌，芽孢卵圆形、近端位，在庖肉培养基中生长时，混浊、产气、发臭、能消化肉渣。

肉毒梭菌按其所产毒素的抗原特异性分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。除G型菌之外，其它各型菌分布相当广泛。我国各地发生的肉毒中毒主要是A型和B型菌。E型和C型菌也发现过肉毒中毒。至于D型和F型菌，我国尚未见到由此而发生的肉品中毒事件。

肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。

3 材料

3.1 样品

罐头食品，豆类、谷类等发酵食品。

3.2 菌种

肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）

某种梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）

3.3 培养基与试剂

庖肉培养基；卵黄琼脂培养基；明胶磷酸盐缓冲液；肉毒分型抗毒诊断血清；胰酶（活力1:250）；革兰氏染色液。

3.4 其它

离心机和离心管；均质器；恒温箱，显微镜，厌氧培养装置（常温催化除氧式或碱性焦性没食子酸除氧式）；吸管，注射器，接种，载玻片，小白鼠等。

4 流程

5 步骤

5.1 样品处理

液体样品直接接种，固体或半固体样品加入等量明胶磷酸盐缓冲液研碎后接种。

5.2 培养增菌

5.2.1 增菌培养

取庖肉培养基5支，分别标记1～5号，煮沸10～15min后，做如下处理：

1号：急速冷却，接种检样均质液1～2ml。

2号：冷却至60℃，接种检样均质液1～2ml，继续于60℃保温10min，急速冷却。

3号：接种检样均质液1～2ml，继续煮沸加热10min，急速冷却。

4号：急速冷却，接种肉毒梭菌菌种。

5号：急速冷却，作为空白对照。

以上5支试管于30℃厌氧培养5d，若无生长，再培养10d，到期无生长，即可报告“未发现肉毒梭菌”。若有生长，取培养物进行离心（300rpm，15min），上清液做毒素检测，沉淀用于分离培养。

5.3 毒素检测

5.3.1 制备注射液

用上述培养物的上清液制备5组注射液。

①上清液不做任何处理。

②胰酶激活处理液，即上清液9ml加1％胰酶（活力1:250）水溶液1ml，37℃保温60min，不时搅动。

③胰酶激活处理液1ml，加入1ml多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀后37℃保温，作用30min。

④胰酶激活处理液1ml，加入1ml明胶磷酸盐缓冲液，混匀后煮沸10min。 

⑤胰酶激活处理液1ml，加入1ml明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可。

5.3.2腹腔注射

每组2只小白鼠（体重为15～20g）分别注射上述①～⑤号注射液，每只腹腔注射0.5ml。另以2只小白鼠作为对照，每只腹腔注射经灭菌的明胶磷酸盐缓冲液0.5ml。对各组小白鼠以相同条件精心饲养，观察4d。

5.2.2检出试验

注射液中若有毒素存在，小白鼠一般多于24h之内发病死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难、呼吸呈风箱式、腰部凹陷、宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。

肉毒毒素是一种蛋白质，分为有活性和无活性两种状态，非活性的肉毒毒素可被胰酶激活而具毒性。因此，①组动物存活，而②组死亡，仍能说明上清液中可能含有肉毒毒素。

5.2.3 证实试验

③组～⑤组为毒素检测的确证试验。若③组、④组动物均获得保护性存活，仅⑤组小白鼠以特有症状死亡则可以判定培养液中有肉毒毒素存在。必要时应进行毒素定型试验，并测定检样中肉毒毒素的毒力。

5.3 分离培养

5.3.1 分离培养

选取经毒素检测试验证实含有肉毒毒素的前述增菌培养物的沉淀物，加无菌生理盐水稀释至原体积（必要时可选适宜的加热处理方式重复一次），取菌液划线接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。

5.3.2 产毒培养

根据菌落形态及染色镜检菌体形态，挑取可疑菌落接种于庖肉培养基，于30℃培养5d，进行培养特征检查确证试验。

5.3.3 培养检查

取庖肉培养液接种卵黄琼脂平板两块，分别在需氧和厌氧条件下，于35℃培养48h，观察生长情况及菌落形状。肉毒梭菌只有在厌氧情况下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特性的菌落，而在需氧条件下则不生长。

6 结果

详细记录试验过程和现象，按记录结果报告样品检验结论。

7 思考

7.1 肉毒梭菌有无芽孢？是需氧菌还是厌氧菌？

7.2 肉毒梭菌引起的食物中毒是感染型还是毒素型食物中毒？两者有何区别？