实验——沙门氏菌属（Salmonella）的检验

1 目的

1.1 理解沙门氏菌属生化反应及其原理

1.2 掌握沙门氏菌属血清因子使用方法

1.3 掌握沙门氏菌属的系统检验方法

2 原理

沙门菌属是一大群寄生于人类和动物肠道，其生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌。种类繁多，少数只对人致病。其他对动物致病，偶尔可传染给人。主要引起人类伤寒，副伤寒以及食物中毒或败血症。在世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二位。

食品中沙门氏菌的检验方法有五个基本步骤：1 前增菌；2 选择性增菌；3 选择性平板分离沙门氏菌；4 生化试验，鉴定到属；5 血清学分型鉴定。目前检验食品中的沙门氏菌是按统计学取样方案为基础，25g食品为标准分析单位。本实验以蛋品为检测样品，以已知的沙门氏菌和大肠埃希氏菌为对照。

3 材料

3.1 菌种

沙门氏菌（Salmonella sp.）

大肠埃希氏菌（E.col.）

3.2 检样

冻肉、蛋品、乳品等。

3.3 培养基

缓冲蛋白胨水（BP）、氯化镁孔雀绿（MM）增菌液、四硫酸钠煌绿（TTB）增菌液、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、SS琼脂、EMB琼脂、亚硫酸铋琼脂（BS）、三糖铁琼脂（TSI）、蛋白胨水、尿素培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、鸟氨酸脱羧酶试验培养基、丙二酸钠培养基、氰化钾（KCN）培养基、ONPG培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、DHL琼脂、HE琼脂。

3.4 试剂

吲哚试剂、V-P试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂，沙门菌A—F多价诊断血清，革兰氏染色液等。

3.5 器具

天平（称取检样用）、均质器或乳钵、显微镜、广口瓶、三角烧瓶、吸管、平皿、金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。

4 流程

 

5 步骤

5.1 前增菌和增菌 

沙门氏菌在食品加工过程中，常常受到损伤而处于濒死状态，因此经过加工的食品检验沙门氏菌时应进行前增菌，即用不加任何抑菌剂的培养基缓冲蛋白胨水（BP），进行增菌，使濒死状态的沙门氏菌恢复活力。一般增菌时间为4h，增菌时间不宜过长，由于BP培养基中没有抑菌剂，时间太长了，杂菌也会相应增多。干蛋品特殊，蛋品中的主要病原菌为沙门氏菌，其在加工过程中受到的损伤又较严重，因此应适当延长前增菌时间，一般为18～24h。

无菌操作称冻蛋取25g样品，加入盛有225mL灭菌缓冲蛋白胨水的500mL广口瓶内（瓶内预放玻璃珠若干粒），塞紧瓶口，充分摇匀。在36±1℃培养4h（干蛋品需培养13～24h），移10ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液，在42℃培养18～24h。同时另取10ml，加入100ml亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液内，在36±1℃培养18～24h。

鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g（25ml）加入灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液，取半量，接种于100mLMM（或TTB）增菌液内，于42 oC培养24h；另半量接种于100mLSC增菌液内，于36±1 oC培养18～24h。

5.2 分离

取增菌液和混合液各1环，分别划线接种于一个BS平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。于36±1 oC培养18～24h（DHL、HE、WS、SS）或40～48h（BS），观察各个平板上生长的菌落。先观察混合菌种平板，再检查样品平板上有无可疑菌落，挑取菌种平板和样品平板上的可疑菌落进行革兰氏染色与镜检。

5.3 三糖铁高层琼脂初步鉴别

将上述革兰氏阴性杆菌的可疑菌落，挑取数个接种一支三糖铁高层琼脂斜面，于36±1 oC培养18～24h，并根据表4-1初步判断是否可疑沙门氏菌。

5.4 生化试验

在接种三糖铁琼脂的同时，接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各1管，于36±1 oC培养18～24h，必要时可延长至48h，按表4-2判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、A2和B1，其它5种反应结果均可以排除。

表4－2  肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表

5.4.1 反应序号A1 

典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸3项中有1项异常，按表4-3可判定为沙门氏菌。如有2项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。

表4－3  沙门氏菌属生化鉴别表

5.4.2 反应序号A2     

可先作血清学鉴定，如A～F多价O血清不凝聚时，补做甘露醇和山梨醇试验，按表4-4判定结果。

表4-4

5.4.3 反应序号B1 

三糖高层斜面产酸的菌株可予以排除，不产酸的应该先作血清学鉴定。如A～F多价O血清不凝聚时，补做鸟氨酸、ONPG，水杨苷、棉子糖和半动力试验。按表4-5 判断结果。必要时按表4-6进行沙门氏菌生化群的鉴别

表4－5  沙门氏菌属各生化群的鉴别

表4－6  沙门氏菌属各生化群的鉴别

5.5 血清学分型鉴定

5.5.1  抗原的准备

一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如 2.5%～3%）培养基上检查，O抗原在干燥环境中发育较好；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3～0.4%半固体琼脂的小玻管1～2次，自远端取菌培养后再检查。

5.5.2  O抗原的鉴定

用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。

被A～F多价O血清凝集者，一次用O4、O3.10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3.10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。

不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：

O多价1  A，B，C，D，E，F群（并包括6，14群）

O多价2  13，16，17，18，21群

O多价3  28，30，35，38，39群

O多价4  40，41，42，43群

O多价5  44，45，47，48群

O多价6  50，51，52，53群

O多价7  55，56，57，58群

O多价8  59，60，61，62群

O多价9  63，65，66，67群

5.5.3  H抗原的鉴定

属于A～F各O群的常见菌型，依次用表7所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。

表4-7   A～F群常见菌型H抗原表

不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：

H多价1  a，b，c，d，i

H多价2  eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gq，mt，gz51

H多价3  k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40

H多价4  1，2；1，5；1，6；1，7；z6

H多价5  z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38

H多价6  z39，z41，z42，z44

H多价7  z52，z53，z54，z55

H多价8  z56，z57，z60，z61，z62

每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。

检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必作位相变异检查。

5.5.4  Vi抗原的鉴定

用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林伤寒沙门氏菌。

6 结果

综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。

7 思考题

7.1 如何提高沙门氏菌得检出率？

7.2 沙门氏在三糖铁培养基上的反应结果如何？为什么？

7.3 沙门氏菌检验有哪五个基本步骤？

7.4 食品中能否允许有个别沙门氏菌存在？为什么？